李小俊，李 欣，陳曉麗，趙毅強，路永強，王 棟*

(1.中國農業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.中國農業(yè)大學 生物學院，北京100193;3.北京市畜牧總站,北京 100107)

線粒體是細胞內通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量的重要細胞器[1-4]，可根據(jù)內外刺激發(fā)生融合、裂變、運輸和自噬等復雜變化[5-7]。哺乳動物精子變形過程中，線粒體在數(shù)量、形狀、結構等方面發(fā)生了顯著變化，線粒體嵴貼附在線粒體外膜內側，增大了線粒體內彌散的空泡化基質空腔，并最終形成月牙狀的線粒體，螺旋式包裹在精子鞭毛中段，形成線粒體鞘，為精子提供生存、運動所需的ATP[8-15]，對精子尾部骨架形態(tài)和功能發(fā)揮重要作用。然而，在精子形成過程中線粒體鞘形成的調節(jié)過程仍有待確定。磷脂酶D家族成員6(Pld6/MitoPld)是物種間保守的磷脂酶D蛋白超級家族成員，定位于線粒體外膜，可以水解心磷脂(cardiolipin, CL)，產(chǎn)生信號分子磷脂酸(phosphatidic acid, PA)，誘導線粒體融合[7,16-19]，Pld6缺陷會導致小鼠線粒體錯誤定位于中心體周圍，影響精子形成正常形態(tài)[20]。甘油激酶樣蛋白1(glycerol kinase-like 1, Gykl1)和甘油激酶2(glycerol kinase 2, Gyk2)可以與Pld6相互作用，激活線粒體聚集所依賴的Pld6和PA,Gykl1和Gyk2缺失會使Pld6和PA激活受阻，導致精子線粒體形態(tài)異常、線粒體鞘無序排列和精子尾部缺陷，并使精子ATP的產(chǎn)生失控[21]。由此可見，Pld6對于小鼠形成正常功能的精子線粒體鞘至關重要，而該基因在精子形成過程中的表達尚不清楚，對于牛的研究未見報道。精子線粒體形態(tài)和功能的正常形成，直接影響到種公牛的精液品質和精子活力，進而影響其繁殖力。本研究在奶牛圓形、長形精子細胞和附睪尾精子轉錄組研究的基礎上，檢測了精子變形過程中3種不同形態(tài)細胞間差異表達基因Pld6的表達水平，并預測了牛Pld6蛋白結構，為進一步研究該基因在牛精子形成中的重要作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

HistoGene LCM Frozen Section Staining Kit(Life technology)；SG高純總RNA提取試劑盒、Thermo First cDNA Synthesis Kit、2×SG Green qPCR Mix (SinoGene)。

1.2 牛睪丸及附睪組織的采集

選取3頭健康狀況良好、15～17月齡、體況相近、有正常生育能力的荷斯坦公牛，用滅菌手術剪采集睪丸和附睪組織，分別置于保鮮袋中，標注后迅速置于冰盒中運回實驗室。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛附睪尾精子的采集及活力檢測 用手術剪從睪丸上剝離出附睪尾組織，并置于裝有PBS的RNase-free離心管(50 mL)中，標記后剪碎，于4 ℃靜置30 min，使精子從附睪尾中充分游離釋放，小心吸取上清，收集附睪尾精子。取1 μL上述精液，稀釋10倍后使用血細胞計數(shù)板，在400×物鏡下統(tǒng)計直線運動的精子占總精子數(shù)量的百分率，以3個視野的平均數(shù)作為精子活力等級，活力高于50%的精子用于后續(xù)試驗。

1.3.2 牛圓形及長形精子細胞的獲取 將新鮮離體睪丸剪成1.0 cm×0.6 cm×0.4 cm的組織塊，用OCT包埋后置于液氮中速凍2～3 min，迅速置于預冷的-20 ℃冷凍切片機內平衡30 min，將樣品固定后，修片厚度為20 μm，正式切片時厚度調為5 μm，用PEN 2.0膜玻片(RNase-free)貼片后，置于-80 ℃儲存?zhèn)溆没蛑苯邮褂迷噭┖腥旧?。然后采用Leica LMD7000系統(tǒng)確認染色切片中的圓形、長形精子細胞，沿目標細胞邊緣劃線并切割。切割細胞因自身重力落到含細胞裂解液的收集管蓋子中，切割完畢后取下收集管，加入75 μL裂解液，按緊蓋子，反復顛倒2 min，收集細胞，-80 ℃或液氮保存?zhèn)溆?。每張膜玻片的切割時間控制在40 min以內[22]。

1.3.3 樣本總RNA提取及cDNA合成 參照TRizol使用說明書提取細胞樣品總RNA，用超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度，按照反轉錄試劑盒操作說明,以Oligo(dT)18為引物，將質量合格的RNA反轉錄合成cDNA。

1.3.4 差異基因篩選 通過RNA-seq對奶牛圓形、長形精子細胞及附睪尾精子進行轉錄組測序，采用DESeq進行基因差異表達分析，比較圓形、長形精子細胞及附睪尾精子的轉錄組數(shù)據(jù)，并選取|log2Ratio|≥1和q<0.05的基因作為差異表達基因，利用Blast2GO，得到每個基因對應的GO條目，通過差異基因GO富集分析，得到這些差異基因顯著相關的生物學功能，并挑選與線粒體相關的條目，然后，根據(jù)基因功能篩選差異基因用于qPCR分析。

1.3.5 引物設計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫牛Pld6基因的mRNA序列(登錄號：NM_001271990.1)和beta-肌動蛋白基因(β-actin)序列(登錄號：NM_173979.3)，使用NCBI在線工具設計PCR引物。引物信息如表1所示。

表1qPCR引物信息

Table1Theinformationofprimersdesigned

1.3.6 差異基因的實時熒光定量PCR(qPCR)分析 以合成的cDNA為模板，按照2×SG Green qPCR Mix反應體系，以β-actin基因為內參進行qPCR擴增。設置3個生物學重復，使用Excel統(tǒng)計附睪尾精子及活力；用Prizm4軟件通過比較Ct方法對基因進行表達量分析。使用“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01差異極顯著。

1.3.7 Pld6生物信息學分析 在Uniprot下載牛Pld6蛋白的氨基酸序列，通過ProtParam軟件(https://web.expasy.org/protparam)分析該蛋白質分子組成、相對分子質量、理論等電點及穩(wěn)定性等參數(shù)，使用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行跨膜區(qū)域分析，通過SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 和Swiss_model軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/) 預測蛋白二級和三級結構，通過NCBI進行BLAST搜索并下載已知同源序列，使用DNAMAN進行多序列比對分析并構建系統(tǒng)進化樹。

2 結 果

2.1 奶牛精子細胞采集

通過浮游法獲取附睪尾精子，其精子形態(tài)如圖1A所示，其頭部呈橢圓形，輪廓規(guī)則，幾乎看不到畸形精子?；盍y(tǒng)計結果：1、2、3號樣品的精子數(shù)分別為1.28×109、1.58×109、1.24×109，其中，直線運動精子占精子總數(shù)的百分率分別為54%、55%、61%，可以用于后續(xù)研究。

奶牛睪丸組織冰凍切片染色后，顯微鏡下可見圓形精子細胞(圖1B)，細胞核偏向細胞一側或居中；長形精子細胞呈長條狀、兩頭鈍圓(圖1D)。LCM切割前圓形精子細胞見圖1B(箭頭指出并紅色圈出的細胞)；LCM切割后的圓形精子細胞見圖1C；LCM切割前長形精子細胞見圖1D(箭頭指向并綠色圈出的細胞)；LCM切割后的長形精子細胞見圖1E，細胞樣品收集情況見圖1F和表2。

2.2 奶牛圓形、長形精子細胞及附睪尾精子總RNA的制備及含量分析

表3顯示，所有細胞樣本總RNA的OD260 nm/OD280 nm為1.91～1.98，純度較高。圓形精子細胞總RNA量為2 000～2 650 ng，長形精子細胞總RNA量為2 700～3 200 ng，而附睪尾精子總RNA含量為2 300～3 700 ng。

A. 普通光學顯微鏡下附睪尾精子形態(tài)(200×);B.切割前圓形精子細胞(箭頭指出并紅色圈出的細胞)(400×)；C.切割后圓形精子細胞(與圖B對應圈出的細胞)(400×)；D.切割前長形精子細胞(箭頭指出并綠色圈出的細胞)(400×)；E.切割后長形精子細胞(與圖D對應圈出的細胞)(400×);F.激光顯微切割儀切割后收集到的細胞(150×)A. Sperm morphology of epididymis tail under general optical microscope(200×)； B.Photo before cutting round spermatids (the arrows point and circle the cells in red) under the microscope of LCM(400×)；C.Photo after cutting round spermatids under the microscope of LCM(the corresponding cells to figure B circled)(400×)；D.Photo befor cutting elongated spermatids (the arrows point and circle the cells in green) under the microscope of LCM(400×)；E.Photo after cutting elongated spermatids (the corresponding cells to figure D circled) under the microscope of LCM(400×)；F.The collected spermatids under the microscope of LCM(150×)圖1 精子細胞的獲取Fig.1 Collection of spermatogenic cells

表2收集到的圓形及長形精子細胞數(shù)

Table2Thenumberofroundandelongatedspermatids

樣本Sample圓形精子細胞數(shù)(R)Round spermatids No.長形精子細胞數(shù)(E)Elongated spermatids No.16 1886 02926 0596 122310 25710 551

表3總RNA濃度檢測

Table3TheconcentrationdetectionofRNA

細胞類型Cell typeRNA濃度/(ng·μL-1)ConcentrationRNA體積/μLVolumeRNA吸光度比值OD260 nm/OD280 nm總RNA量/ngTotal RNA quantityR151501.942 550240501.922 000353501.912 650E164501.963 200259501.972 950354501.982 700M148501.972 400274501.973 700346501.952 300

R.圓形精子細胞；E.長形精子細胞；M.附睪尾精子。1、2、3分別為3類細胞的生物學重復

R. Round spermatid; E. Elongated spermatid;M. Epididymal sperm.1,2,3. The 3 biological duplication of 3 cell types

2.3 差異基因篩選

通過DESeq進行基因差異表達分析，共發(fā)現(xiàn)5 349個基因在精子形成階段差異表達(|log2Ratio|≥1，q<0.05)，其中，圓形到長形精子的差異表達基因為994個(246個上調，748個下調)；長形到附睪尾精子差異表達基因為4 771個(1 613個上調，3 158個下調)，根據(jù)基因注釋，將這些基因進行富集分析，發(fā)現(xiàn)了與線粒體及精子變形相關的功能條目及差異基因(表4)，其中，Pld6在圓形、長形和附睪尾精子中的表達量(FPKM值)分別為492.00、1 870.67和0.00，即在圓形變形為長形精子細胞的過程中表達量升高，為圓形精子細胞的3.8倍，而在附睪尾精子中表達量降低為0，且該基因富集于線粒體融合(mitochondrial fusion)功能條目中，根據(jù)其測序數(shù)據(jù)及注釋的重要功能，篩選該基因進行后續(xù)分析研究。

表4與線粒體相關的功能條目及富集的基因數(shù)

Table4Mitochondrial-relatedGOtermsandenrichedgenenumber

GO條目GO term功能描述Description差異基因數(shù)Gene numberGO:0007005線粒體組織Mitochondrion organization99GO:0008053線粒體融合Mitochondrial fusion8GO:0000422線粒體降解Mitochondrion degradation24GO:0007007線粒體內膜Inner mitochondrial membrane organization4GO:0051646線粒體定位Mitochondrion localization5GO:0007006線粒體膜Mitochondrial membrane organization14GO:0042775線粒體ATP合成耦合電子傳遞Mitochondrial ATP synthesis coupled electron transport16GO:0000266線粒體分裂Mitochondrial fission13

2.4 Pld6在奶牛圓形、長形精子細胞和附睪尾精子中的轉錄表達檢測

Pld6基因的qPCR檢測結果(圖2)顯示，Pld6基因在圓形到長形精子細胞期間表達量升高，而在后期的精子成熟過程中表達量降低，與測序數(shù)據(jù)一致。

2.5 Pld6蛋白的特征分析

ProtParam分析表明，Pld6蛋白由220個氨基酸組成，分子式為C1128H1799N331O306S8，相對分子質量為25 150.21，理論等電點為9.77，不穩(wěn)定指數(shù)為61.43，屬于不穩(wěn)定蛋白。通過SOPMA對其二級結構分析顯示，該蛋白含有39.55%α螺旋，29.09%隨機卷曲，20.91%延伸鏈，10.45%β折疊(圖3)，TMHMM對其跨膜結構預測發(fā)現(xiàn)，第1～9氨基酸位于膜外，10～32氨基酸是跨膜區(qū)域，33～220氨基酸位于膜內，其中跨膜區(qū)域為該蛋白在線粒體外膜定位區(qū)域(圖略)。對其三級結構進行預測(圖4)，α螺旋區(qū)域位于外圍，β折疊區(qū)域被α螺旋區(qū)域包圍在內側，呈喇叭狀。

R．圓形精子細胞；E．長形精子細胞；M．附睪尾精子。標有不同大寫字母和不同小寫字母者分別表示組間差異極顯著和差異顯著(P<0.01,P<0.05)R．Round spermatid; E．Elongated spermatid; M．Epididymal sperm.Those marked with different capital letters and different lowercase letters respectively indicate extremely significant differences (P<0.01) and significant differences (P<0.05) among different groups圖2 精子變形期間Pld6基因qPCR檢測結果Fig.2 Relative expression of Pld6 gene during spermiogenesis

2.6 奶牛Pld6蛋白同源性及進化分析

利用NCBI的BLASTp對牛Pld6進行同源搜索，結果表明，牛(Bostaurus)與小鼠(Musmusculus)、黑猩猩(Pantroglodytes)、人(Homosapiens)、光滑爪蟾(Xenopuslaevis)、非洲爪蟾(Xenopustropicalis)和斑馬魚(Daniorerio)的同源性分別為85%、85%、84%、60%、60%和55%。用DNAMAN對下載蛋白序列的多重比對(圖5)發(fā)現(xiàn)，這些蛋白有一個明顯的Pld家族區(qū)域H(X)K(X4)D (HKD)，是該蛋白的活性區(qū)域。對這7個蛋白建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，Pld6進化分為魚類、兩棲類和哺乳類3個分支，符合動物分類學地位。

藍色.α螺旋；綠色.β折疊；紅色.延伸鏈；紫色.隨機卷曲Blue.Alpha helix; Green. Beta sheet; Red. Extended strand; Purple.Random coil圖3 Pld6蛋白的二級結構預測結果Fig.3 Secondary structure prediction of Pld6 protein

A.α螺旋；B.β折疊；C.延伸鏈；D.隨機卷曲A.Alpha helix; B. Beta sheet; C. Extended strand; D. Random coil圖4 Pld6蛋白的三級結構預測結果Fig.4 Prediction of tertiary structure of Pld6 protein

3 討 論

結構是正常功能充分發(fā)揮的基礎，精子變形期間尾部正常結構的形成，對精子活力及受精能力形成具有重要作用[13-15,22-24]，本研究通過對精子形成過程中大量基因的差異表達分析，發(fā)現(xiàn)了與精子尾部中段線粒體分布和形態(tài)結構相關的Pld6基因，又利用后續(xù)qPCR結果驗證了其差異表達的真實性，并通過對該蛋白可能的結構和功能分析，對該基因與精子尾部結構和功能的關系進行了科學推斷。

哺乳動物精子形成過程中，精子細胞形態(tài)發(fā)生了復雜變化[8-12]，為探究精子變形的機制，本實驗室前期對奶牛圓形、長形精子細胞及附睪尾精子進行了轉錄組測序，測序數(shù)據(jù)分析結果表明，Pld6基因在圓形到長形精子細胞發(fā)育過程中表達量升高，在附睪尾精子中未檢測到其轉錄表達，通過GO分析，將該基因富集在mitochondrial fusion條目。研究表明，線粒體形態(tài)通過線粒體融合和裂變的動態(tài)平衡維持，Pld6基因參與該平衡的維持[25-26]，可能影響精子尾部特異的線粒體鞘形態(tài)的形成和維持。而Pld6激活失敗或缺陷會使小鼠線粒體錯誤定位于中心體周圍，導致精子形成停滯，或使精子線粒體形態(tài)異常、線粒體鞘無序排列和精子尾部缺陷[20-21]，因此，推測該基因還對牛精子線粒體鞘形成發(fā)揮重要作用。而目前尚未見到對牛Pld6功能的研究，為進一步探索該基因功能，本研究對牛Pld6蛋白質序列進行了生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在不同物種間具有保守的H(X)K(X4)D (HKD)結構域，并呈現(xiàn)酶活性區(qū)域特征，推測在圓形精子向長形精子發(fā)育過程中，Pld6基因表達產(chǎn)物可通過該功能域催化CL產(chǎn)生PA，并進一步通過該信號分子，誘導精子細胞線粒體向尾部中段聚集和相互融合，促進了精子尾部特異形狀和功能的形成，該推斷可通過相關文獻[7,27-29]得到驗證。研究表明，小鼠Pld6定位于線粒體外膜[20,30]，其三級結構呈喇叭狀，該蛋白活性區(qū)域為β折疊，處于喇叭狀結構內部[31]，這與本研究預測的牛Pld6蛋白結構相似。同時，本研究關于該基因蛋白序列同源物種的聚類分析表明，該蛋白通過長期進化，已分化為魚類、兩棲類和哺乳類3個進化方向，其中，牛與小鼠關于Pld6蛋白具有最接近的進化趨勢。聚類分析結果為將來采用比較組學技術，充分利用小鼠研究成果，指導牛上深入開展該基因及蛋白在精子形成中對線粒體鞘形成的作用提供一定的理論基礎，對提高種公牛繁殖力有積極意義。

圖5 不同物種Pld6蛋白序列比對結果Fig.5 The sequence alignment of Pld6 protein among different species

圖6 Pld6蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of Pld6 protein

4 結 論

本研究根據(jù)小鼠研究推斷牛精子變形過程中，Pld6基因表達增多可誘導線粒體向精子細胞尾部中段聚集，促進了線粒體鞘的正常形成，對確保牛精子活力及受精能力具有重要作用，為進一步研究Pld6基因功能，提供了重要基礎。關于Pld6基因的表達調控及其產(chǎn)物對精子中線粒體形態(tài)形成和功能發(fā)揮的作用，還需要進一步的研究驗證。