范子玲，宋玉錫，張 江，趙 暢，白云龍，孫書函，夏 成

(黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 163319)

在過去幾十年來，奶牛產(chǎn)奶量在急劇的增加，而生殖性能卻逐漸下降。高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后的繁殖效率降低，嚴重影響著世界范圍內(nèi)奶牛業(yè)的健康發(fā)展[1]。高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后的繁殖效率降低，產(chǎn)后第一次排卵和受胎的天數(shù)延長[2]。近25年來，英國和美國奶牛的產(chǎn)后首次授精受胎率大約以每年0.5%和1%的速度下降[3]。因此，高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后繁殖障礙嚴重影響著世界范圍內(nèi)奶牛業(yè)的健康發(fā)展。而卵巢靜止屬于奶牛產(chǎn)后乏情中的一種，約占奶牛卵巢疾病的26.3%，有時可高達50%以上[4]。在現(xiàn)代奶牛業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展中，卵巢靜止發(fā)病機理的闡明及防治成為一項重要的研究。

目前，與奶牛卵巢靜止相關(guān)的研究主要是關(guān)注某些物質(zhì)對卵泡生長或卵巢活性等的影響[5-7]，對卵巢靜止奶牛和健康奶牛整體代謝物變化的研究較少。而代謝物是生命系統(tǒng)調(diào)控的下游產(chǎn)物，能夠最直接全面的反映出機體的代謝狀態(tài)，許楚楚等[8]應用核磁共振技術(shù)確立了奶牛產(chǎn)后乏情的血漿差異代謝物。范子玲等[9]應用GC/MS技術(shù)對卵巢靜止奶牛血漿代謝譜進行了分析。

有關(guān)奶牛血漿的代謝圖譜分析已有進展，但尚未有從奶牛乳清層面進行的代謝研究。奶牛乳清樣品產(chǎn)量大，易獲取，作為檢測樣本更方便。本研究利用代謝組1H-NMR技術(shù)對卵巢靜止奶牛的乳清和血清進行檢測，通過對差異代謝物進行代謝通路分析，歸納出卵巢靜止奶牛體內(nèi)的代謝異常，為今后深入研究奶牛卵巢靜止的發(fā)生機制和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗開展于黑龍江省某大型集約牛場，奶牛自由采食全混合日糧(TMR)，采用散欄式飼養(yǎng)模式。在產(chǎn)后45～60 d，隨機選取年齡、胎次、體況相近，泌乳量約為10噸的健康經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛。14頭正常發(fā)情奶牛為對照組(A)，14頭卵巢靜止奶牛為試驗組(B)。泌乳早期TMR主要包括:精料、青貯、干草、脂肪，其含量分別為8～9 kg、17～20 kg、3.5～4.0 kg、300～400 g；TMR營養(yǎng)主要包括:干物質(zhì)(DM)、粗蛋白、脂肪、鈣(Ca)、磷(P)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、產(chǎn)奶凈能，測定其水平分別為55.60%、16%、5.60%、180 g、116 g、39.10%、20.30%、7.32 MJ·kg-1。

發(fā)情奶牛的判定標準：選取產(chǎn)后45～60 d的奶牛，能夠自主發(fā)情且發(fā)情癥狀明顯，經(jīng)直腸和B超檢查，子宮無異常，雙側(cè)或單側(cè)卵巢上出現(xiàn)能夠發(fā)生排卵的卵泡(直徑15～20 mm)。

卵巢靜止奶牛的判定標準：選取產(chǎn)后45～60 d沒有發(fā)情表現(xiàn)的奶牛，經(jīng)直腸和B超檢查，子宮無異常，雙側(cè)卵巢均沒有卵泡發(fā)育，或發(fā)育卵泡直徑小于8 mm。

1.2 樣品采集

血液樣品的采集：于產(chǎn)后45～60 d，清晨采集空腹奶牛尾靜脈血液10 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液12 000 r·min-1離心10 min，取上清液分裝于1.5 mL離心管中，封口膜包好，液氮速凍，并迅速置于-80 ℃超低溫冰箱保存，待測。

乳樣的采集：乳樣采集與血液采集同時進行，棄前三把乳汁，利用加州乳房炎檢測法(CMT)對乳汁樣品進行隱性乳房炎的篩查，棄掉有凝膠反應陽性及可疑奶牛樣品，將正常奶牛乳樣用封口膜包好，液氮速凍，并迅速置于-80 ℃超低溫冰箱保存，待測。

1.3 1H-NMR試驗

1.3.1 樣品前處理 血清樣品制備：將血清樣品從-80 ℃冰箱中取出，于室溫下解凍，每管取600 μL血清加入1 200 μL的甲醇溶液，混勻并于-20 ℃靜置20 min充分提取。之后12 000 r·min-1, 4 ℃離心15 min，取上清，用氮吹儀去除甲醇，當溶液剩余1/3時，用封口膜封上管口并戳數(shù)個小孔，-80 ℃冰箱冷凍過夜，用冷凍干燥儀將樣品凍干成粉末，將凍干的血清樣品溶于600 μL含0.05% (w/v)TSP的99.8%的D2O磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol·L-1Na2HPO4，0.2 mol·L-1NaH2PO4，pH=7.0)，渦旋,并于12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min后，取550 μL上清液至5 mm核磁管中待測。

乳清樣品制備：將乳汁樣品從-80 ℃冰箱中取出，于室溫下解凍，每管取2 mL乳汁于10 mL離心管中，再加入4 mL甲醇：乙睛(v/v，1∶1)，混勻并于-20 ℃靜置20 min充分提取。其余步驟同血清樣品制備。

1.3.21H-NMR檢測和數(shù)據(jù)處理 血清和乳清樣品的1H-NMR檢測在500 MHz核磁共振波譜儀(AVANCE III, Bruker, Switzerland)上進行。測試溫度為298 K，D2O和TSP分別用于場頻鎖定和化學位移參考(1H，0.00 ppm)。脈沖序列采用一種橫向弛豫編輯過的Carr-PurcellMeiboom-Gill(CPMG)序列(90(τ-180-τ) n-acquisition)和10 ms的總自旋回波延遲(2nτ)。1H-NMR采集掃描次數(shù)(NS)為32，采樣點數(shù)(TD)為32 k，光譜寬度為10 000 Hz。

血清和乳清樣品的所有1H-NMR數(shù)據(jù)均需在Topspin軟件中進行零點、相位、基線的校正，將內(nèi)參TSP的峰位置調(diào)成零點位移。將處理后的譜圖導入R軟件中，再次對譜圖進行零點、基線、相位的校正。對于血清樣品譜圖，在0.8～8.5 ppm化學位移區(qū)間內(nèi)，采用0.015 ppm單位進行等間距分段積分，來降低數(shù)據(jù)點數(shù)，同時除去水峰及其影響區(qū)域4.5～5.18 ppm區(qū)間內(nèi)的共振信號。對于乳清樣品譜圖，積分區(qū)間為0.75～8.4 ppm，水峰及其影響區(qū)域為4.4～5.175 ppm。所有的譜圖數(shù)據(jù)進行PQN(probability quotient normalized)標準化處理，之后進行Pareto(mean-centered and pareto-scaled)平均中心化和標度化處理。

運用Chenomx軟件進行化合物的指認，對峰進行擬合對比，選定峰型匹配良好的化合物，并結(jié)合代謝物組學數(shù)據(jù)庫MMCD和HMDB等，再以統(tǒng)計全相關(guān)譜(STOCSY)分析方法對1H-NMR譜進行峰代謝物的輔助指認。

1.3.3 統(tǒng)計分析 經(jīng)過前期處理的1H-NMR數(shù)據(jù)導入R軟件中，進行多元統(tǒng)計分析和單變量分析。

多元統(tǒng)計分析先采用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)來觀察各樣本之間的總體分布和整個分析過程的穩(wěn)定性，然后用有監(jiān)督的偏最小二乘法OSC-PLS-DA分析來區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。單變量分析主要采用t-檢驗(正態(tài)分布)和秩和檢驗(非正態(tài)分布)評估代謝物組間變化的顯著性，通過Benjamini & Hochberg方法校正組間代謝物變化倍率值及其相關(guān)P值[10-11]，在對數(shù)(log2)轉(zhuǎn)化后進行編碼。結(jié)合兩種統(tǒng)計分析方法，最終篩選出差異代謝物。

1.3.4 代謝通路分析 用KEGG數(shù)據(jù)庫搜索差異代謝物的相關(guān)代謝通路，再用代謝物通路分析軟件MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)對差異代謝物進行代謝通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)情和卵巢靜止奶牛乳清和血清典型1H-NMR圖譜

如圖1所示，A、B圖分別為發(fā)情組和卵巢靜止組奶牛乳清典型的1H-NMR譜圖，圖中所有信號峰處于0.5～8.5 ppm，除去4.4～5.175 ppm水峰及其影響區(qū)域，并將低場區(qū)5.175～8.5 ppm進行擴大200倍以便于觀察，其中29種化合物被指認出來。

A.發(fā)情組奶牛乳清典型的1H-NMR譜圖；B. 卵巢靜止組奶牛乳清典型的1H-NMR譜圖。1. β-羥丁酸；2. 乳酸；3. 丙氨酸；4. 乙酸；5. 乙酰胺；6. N-乙酰碳水化合物；7. 乙酰膽堿；8. 琥珀酸；9. 戊鄰酮二酸鹽；10. 檸檬酸；11. 肌酸；12. 磷酸肌酸；13. 肌酐；14. 膽堿;15. 磷酸膽堿；16. 甘油磷酸膽堿；17. 乳糖；18. 甲醇；19. ?；撬幔?0. 甘氨酸；21. 肌醇；22. 乙醇酸；23. 半乳糖；24. 麥芽糖；25. 尿囊素；26. 葡萄糖-1-磷酸；27. 乳清酸；28. 延胡索酸；29. 馬尿酸A.Typical 1H-NMR spectrum of whey of estrus cows; B. Typical 1H-NMR spectrum of whey of ovarian quiescence cows. 1. β-hydroxybutyrate; 2. Lactate; 3. Alanine; 4. Acetate; 5. Acetamide; 6. N-acetylcarbohydrates; 7. Acetylcholine; 8. Succinate; 9. 2-oxoglutarate; 10. Citrate; 11. Creatine; 12. Creatine phosphate; 13. Creatinine; 14. Choline; 15. O-phosphocholine; 16. Glycerophosphocholine; 17. Lactose; 18. Methanol; 19. Taurine; 20. Glycine; 21. myo-inositol; 22. Glycolate; 23. Galactose; 24. Maltose; 25. Allantoin; 26. Glucose-1-phosphate; 27. Orotate; 28. Fumarate; 29. Hippurate圖1 發(fā)情和卵巢靜止奶牛乳清樣品1H-NMR典型譜圖(500 Hz)Fig.1 Typical 1H-NMR spectrums (500 Hz) of whey from estrus and ovarian quiescence cows

如圖2所示，A、B圖分別為發(fā)情組和卵巢靜止組奶牛血清典型的1H-NMR譜圖，圖中所有信號峰處于0.5～8.5 ppm，除去4.5～5.18 ppm水峰及其影響區(qū)域，并將低場區(qū)5.18～8.5 ppm擴大10倍,以便于觀察，其中26種化合物被指認出來。

A.發(fā)情組奶牛血清典型的1H-NMR譜圖；B. 卵巢靜止組奶牛血清典型的1H-NMR譜圖。1. 異亮氨酸；2. 亮氨酸；3. 纈氨酸；4. β-羥丁酸；5. 乳酸；6. 丙氨酸；7. 乙酸；8. 谷氨酸；9. 谷氨酰胺；10. 丙酮酸；11. 琥珀酸；12. 檸檬酸；13. 肌酐；14. 肌酸；15. 磷酸肌酸；16. 磷酸膽堿；17. 葡萄糖；18. 甲醇；19. 甘氨酸；20. 肌醇；21. 尿囊素；22. 酪氨酸；23. 苯丙氨酸；24. 馬尿酸；25. 組氨酸；26. 甲酸A.Typical 1H-NMR spectrum of serum of estrus cows; B. Typical 1H-NMR spectrum of serum of ovarian quiescence cows. 1. Isoleucine; 2. Leucine; 3. Valine; 4. β-hydroxybutyrate; 5. Lactate; 6. Alanine; 7. Acetate; 8. Glutamate; 9. Glutamine; 10. Pyruvate; 11. Succinate; 12. Citrate; 13. Creatinine; 14. Creatine; 15. Creatine phosphate; 16. Phosphocholine; 17. Glucose; 18. Methanol; 19. Glycine; 20. Myo-inositol; 21. Allantoin; 22. Tyrosine; 23. Phenylalanine; 24. Hippurate; 25. Histidine; 26. Formate圖2 發(fā)情和卵巢靜止奶牛血清樣品1H-NMR典型譜圖(500 Hz)Fig.2 Typical 1H-NMR spectrums (500 Hz) of serum from estrus and ovarian quiescence cows

2.2 發(fā)情和卵巢靜止奶牛乳清和血清代謝物的多元統(tǒng)計分析

PCA結(jié)果顯示，每組樣品存在一定的分離趨勢，為濾除與分組無關(guān)變量，進一步進行OSC-PLS-DA。由奶牛乳清和血清樣品1H-NMR數(shù)據(jù)的OSC-PLS-DA得分圖(圖3a，3b)可知，發(fā)情組和卵巢靜止組奶牛分列左右，明顯分開，說明兩組間差異顯著。由彩色S曲線圖(圖3c，3d)可知，乳清中有11種差異代謝物組間變化顯著，血清中有11種差異代謝物組間變化顯著。甲醇是由于樣品處理時揮發(fā)不干凈造成的差異，所以不計入差異代謝物。

a.乳清得分圖;b.血清得分圖：一個點代表一個樣品，橢圓代表95%的置信區(qū)間；A.發(fā)情組(■)；B.卵巢靜止組(●)。c.乳清S曲線圖;d.血清S曲線圖：不同形狀的點代表不同的代謝物，在右上和左下方，離原點越遠差異越顯著a. The whey score chart; b. The serum score chart: One point represents a sample and the ellipse represents the 95% confidence interval; A. Estrous group (■); B. Inactive ovaries group (●). c. The whey S-plot; d. The serum S-plot: dots with different color and shape represent different metabolites; Dots in the upper right and lower left, the farther away from the origin, the more significant difference圖3 發(fā)情和卵巢靜止奶牛乳清和血清的OSC-PLS-DA得分圖和S曲線圖Fig.3 OSC-PLS-DA score plots and S-plots in whey and serum from estrus and ovarian quiescence cows

2.3 發(fā)情和卵巢靜止奶牛乳清和血清代謝物單變量分析

用單變量分析對代謝物進行統(tǒng)計(表1)，篩選出乳清中顯著變化的代謝物13個，卵巢靜止組升高的有琥珀酸、磷酸肌酸、甘氨酸、肌醇、乙醇酸、乳清酸，下降的有丙氨酸、肌酐、磷酸膽堿、乳糖、?；撬?、半乳糖、葡萄糖-1-磷酸。血清中顯著變化的代謝物13個，卵巢靜止組升高的有β-羥丁酸、乙酸、谷氨酰胺、甘氨酸，下降的有丙氨酸、琥珀酸、檸檬酸、肌酐、磷酸膽堿、葡萄糖、肌醇、酪氨酸、組氨酸。

2.4 發(fā)情和卵巢靜止奶牛乳清和血清差異代謝物通路分析

如圖4所示，兩組奶牛乳清(圖4a)差異代謝物主要參與?；撬岷蛠喤；撬岽x、半乳糖代謝、原代膽汁酸生物合成等。兩組奶牛血清(圖4b)差異代謝物主要參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、檸檬酸循環(huán)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等。

表11H-NMR鑒定的發(fā)情組和卵巢靜止組乳清和血清代謝物及組間倍率和P值

Table1Metabolitesinthewheyandserumidentifiedby1H-NMRandtheirfoldchangesandtheP-valuebetweenestrusandovarianquiescencecows

樣品Sample代謝物Metabolite名稱Name化學位移a/ppmChemical shiftlog2(FC)bP乳清Galactose半乳糖4.09(t)-0.74???乳清Alanine丙氨酸1.48(d)-0.45?乳清Succinate琥珀酸2.40(s)0.59??乳清Creatine phosphate磷酸肌酸3.04(s)0.23?乳清Creatinine肌酐3.05(s), 4.07(s)-0.47??乳清O-phosphocholine磷酸膽堿3.22(s), 4.17(s)-1.03?乳清Lactose乳糖3.30 (t), 3.54 (m), 3.57-3.64 (m), -0.63??3.66-3.94 (m), 3.98 (m), 5.24 (d)乳清Taurine牛磺酸3.43(t)-1.50???乳清Glycine甘氨酸3.56(s)0.35???乳清Myo-inositol肌醇3.65(dd)0.16?乳清Glycolate乙醇酸3.95(s)0.25?乳清Orotate乳清酸6.20(s)0.24?乳清Glucose-1-phosphate葡萄糖-1-磷酸5.50(m)-0.88?血清β-hydroxybutyrateβ-羥丁酸1.20(d), 2.31(dd), 2.41(dd)1.01???血清Alanine丙氨酸1.49(d)-0.35???血清Acetate乙酸1.92(s)0.34?血清Glutamine谷氨酰胺2.12(m)0.34??血清Succinate琥珀酸2.38(s)-0.33?血清Citrate檸檬酸3.53(s), 3.67(s)-0.26?血清Creatinine肌酐3.03(s), 4.06(s)-0.18??血清O-phosphocholine磷酸膽堿3.22(s)-0.38?血清Glucose葡萄糖3.25 (dd), 3.38-3.56 (m), -0.26??3.69-3.92 (m), 5.24 (d)血清Glycine甘氨酸3.57(s)0.18?血清Myo-inositol肌醇3.65(dd)-1.18??血清Tyrosine酪氨酸6.91(d), 7.19(d)-0.15?血清Histidine組氨酸7.10(s), 7.90(s)-0.29??

a.峰的多重性：s. 單峰；d. 雙峰；t. 三重峰；m. 多重峰。b.根據(jù)log2(FC)進行編碼，卵巢靜止組相對于發(fā)情組，正數(shù)表示升高，負數(shù)表示下降。*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001

a. Peak multiplicity: s. single; d. doublet; t. triplet; m. multiplet.b.Coded according to the log2(FC),positive numbers means rising, negative numbers means falling in ovarian quiescence cows compared to estrus cows. *.P< 0.05，**.P< 0.01，***.P< 0.001

a.乳清代謝物主要參與的通路；b. 血清代謝物主要參與的通路。氣泡面積表示通路的影響大小，顏色越深表示通路意義越大a.The pathways involved by metabolites in whey; b.The pathways involved by metabolites in serum.Bubble area is proportional to the impact of each pathway, the darker the color, the greater the meaning of the pathway圖4 發(fā)情和卵巢靜止奶牛乳清和血清差異代謝物通路分析Fig.4 Pathway analysis of the differential metabolites in whey and serum of estrus and ovarian quiescence cows

3 討 論

乳中差異代謝物與血中差異代謝物聯(lián)系起來可構(gòu)建成一個代謝互作網(wǎng)絡圖(圖5)，通過網(wǎng)絡圖來進一步揭示差異代謝物與卵巢靜止的關(guān)系，主要表現(xiàn)為：糖代謝過程減弱、氨基酸代謝異常、脂動員增強。

↑和↓分別代表增加和減少，實線箭頭表示乳清中的變化，虛線箭頭表示血清中的變化。①糖代謝；②三羧酸循環(huán)；③脂代謝↑ and ↓ represent increase and decrease, solid arrows indicate changes in whey, dashed arrows indicate changes in serum. ①glucose metabolism; ②tricarboxylic acid cycle; ③lipid metabolism圖5 乳清和血清差異代謝物網(wǎng)絡互作圖Fig.5 The network interaction diagram of differential metabolites in whey and serum

3.1 卵巢靜止奶牛糖脂代謝變化

乳糖是乳中最穩(wěn)定的成分，是維持乳腺正常滲透壓的主要物質(zhì)。只有乳腺才能合成乳糖。由于乳腺中缺乏葡萄糖-6-磷酸酶，限制糖異生，所以乳腺中所需的葡萄糖都來自于血液[12]。因此，卵巢靜止奶牛乳糖降低主要是血中葡萄糖降低或供應不足所引起的。由于泌乳需要大量葡萄糖來合成乳糖[13]，會降低奶牛血糖，引起能量負平衡，從而抑制奶牛發(fā)情。在乳腺內(nèi)乳糖合成酶的催化作用下，一部分葡萄糖先轉(zhuǎn)化為半乳糖，之后再與葡萄糖結(jié)合生成乳糖。其余葡萄糖在乳腺中的代謝包括:(1)轉(zhuǎn)換為葡萄糖-6-磷酸，在磷酸葡萄糖變位酶的作用下生成葡萄糖-1-磷酸，進而產(chǎn)生UDP-半乳糖；(2)進入戊糖磷酸途徑產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；(3)通過三羧酸循環(huán)(TCA)完全氧化供能；(4)轉(zhuǎn)化為甘油進行三酰甘油的合成[14]。在本試驗中,卵巢靜止組奶牛乳中乳糖、半乳糖、葡萄糖-1-磷酸均顯著的下降，這是由于奶牛本身處于能量負平衡狀態(tài)，飼料供應和異生的葡萄糖不能滿足泌乳合成乳糖的需要，也無法滿足奶牛產(chǎn)后生殖機能恢復所需的能量，就無法維持卵巢卵泡的正常發(fā)育。而卵巢靜止奶牛血中葡萄糖、琥珀酸和檸檬酸也降低，提示通過TCA供能的途徑減弱，不能給卵泡提供足夠的能量物質(zhì)，會使NADPH供氫體不足，進而使性激素的合成減少，致使卵泡發(fā)育不良。

卵巢靜止奶牛糖代謝供能不足，NEFA和BHBA升高，刺激機體脂動員增強，提供能量來滿足機體對能量需求[15]。血中乙酸的升高，乙酸在肝細胞中轉(zhuǎn)化成乙酰CoA，此過程中會消耗肝細胞內(nèi)的ATP；BHBA和乙酸生成的乙酰CoA進入TCA，徹底氧化供能[16]。在本試驗中，TCA的氧化供能減弱，機體供能不足，不能緩解能量負平衡。反而，NEFA和BHBA的增加會提高酮病或脂肪肝發(fā)生的風險[17]。而且，NEFA對卵泡顆粒細胞和卵母細胞的生成發(fā)育存在毒性，這些都影響奶牛卵泡的正常發(fā)育，導致奶牛卵巢靜止。

牛磺酸是有機酸和膽汁的主要成分。牛磺酸可通過血液循環(huán)分泌到乳汁中。牛磺酸已被證明可以降低載脂蛋白B100和脂類的分泌，其是極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)的組成部分[18]，VLDL是奶牛肝中的重要轉(zhuǎn)運蛋白，具有轉(zhuǎn)移三酰甘油的作用。因此，本試驗中?；撬岬慕档?，提示奶牛產(chǎn)后處于能量負平衡狀態(tài)，機體體脂動員產(chǎn)生多余三酰甘油，因?；撬峤档蜁绊慥LDL合成，會使更多的三酰甘油沉積肝，影響糖異生供能，會加重能量負平衡，進而影響奶牛產(chǎn)后發(fā)情。

磷酸膽堿參與脂類代謝，是合成磷脂酰膽堿的前體[19]。磷脂酰膽堿在膜介導的信號傳導中起作用。磷脂酸與Raf-1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-1)結(jié)合并促進其募集到質(zhì)膜上，通過與網(wǎng)狀激活系統(tǒng)(Ras)直接相互作用被激活。Ras介導的Raf-1激活導致促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸激酶(PI3K/Akt)激活[20]。在本試驗中，卵巢靜止奶牛血中磷酸膽堿含量降低，可能會使磷脂酸含量降低，影響RAS-MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，進而抑制卵泡發(fā)育，導致奶牛卵巢靜止發(fā)生。

3.2 卵巢靜止奶牛氨基酸代謝變化

酪氨酸、組氨酸和丙氨酸均為生糖氨基酸，都是通過TCA來完成生糖過程。丙氨酸是一種由碳水化合物丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化而來的非必需氨基酸，丙酮酸是葡萄糖酵解產(chǎn)生的關(guān)鍵性中間物質(zhì)。其可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，然后通過TCA實現(xiàn)機體內(nèi)糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化[21]。在本試驗中，卵巢靜止組奶牛血中酪氨酸、組氨酸和丙酮酸含量均下降，提示卵巢靜止奶牛的生糖氨基酸不足或消耗過多。因此，生糖氨基酸供能障礙會引起奶牛卵泡不發(fā)育，造成奶牛卵巢靜止。

谷氨酰胺和甘氨酸既是生糖氨基酸，也是合成谷胱甘肽的前體物質(zhì)[22]，谷胱甘肽也是特別重要的抗氧化劑，保護細胞免受自由基損傷[23]。在雄性和雌性的配子中，谷胱甘肽參與保護這些細胞免受氧化損傷。并且，谷胱甘肽在卵母細胞功能方面的活性包括維持減數(shù)分裂紡錘體形態(tài)，保護紡錘體免受氧化損傷，確保正常的合子形成[24]。兩者在卵巢靜止奶牛血中都升高，提示谷胱甘肽或蛋白質(zhì)分解代謝增強。由于谷胱甘肽合成不足，不能給卵泡細胞提供足夠的抗氧化能力，引起卵泡發(fā)育的氧化應激，造成發(fā)育不良。

3.3 奶牛乳清和血清代謝物的異同

乳中的代謝物來自血液和乳腺的從頭合成，并受到乳腺和哺乳期奶牛代謝狀態(tài)的影響[25]。牛乳中小代謝物主要是乳糖，但乳中還有很多代謝物，如：TCA中間體、氨基酸、有機酸和酮體等。這些代謝物都是由乳腺分泌到牛乳中，由血液中的前體組成[26]。然而，奶牛血液和乳中的成分受到營養(yǎng)攝入、疾病狀態(tài)和哺乳期的影響，對它們之間的具體代謝關(guān)系所知有限[27]。NMR光譜數(shù)據(jù)中共振強度與它們的代謝物濃度成正比，利用先進的統(tǒng)計學方法可以獲得真實的生物信息[28]。Ilves等[29]報道，血漿和乳汁的分子組成之間似乎關(guān)聯(lián)性不大。與乳相比，血液對動物個體的依賴性更高，檸檬酸鹽和乳糖的影響最大，因為它們在乳中含量較多。Maher等[27]指出，牛奶是一個獨特的代謝室，其代謝物成分在很大程度上不受正常情況下血漿成分的影響。然而，三甲胺和二甲基砜在血漿和乳中存在高度的相關(guān)性，并且血漿纈氨酸水平與乳腺中氨基酸分解代謝的差異有關(guān)。因此，血清和乳清中變化不一致的差異代謝物琥珀酸可以得到解釋。琥珀酸鹽是TCA的中間體，并且在線粒體中ATP生成中起關(guān)鍵作用。琥珀酸鹽是幾種代謝途徑交叉路口的重要代謝物，也參與活性氧的形成和消除[30]。由于其參與反應多而復雜，因此，其在卵巢靜止奶牛血清中含量降低，乳清中含量升高及肌醇在血清中含量降低，乳清中含量升高，可能是乳腺特殊的需要，或其他綜合因素的結(jié)果，有待進一步證實。

4 結(jié) 論

本試驗應用1H-NMR技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析、單變量分析及生物信息學分析，篩選出乳清中13種差異代謝物和血清中13種差異代謝物。卵巢靜止奶牛乳清和血清中多數(shù)代謝物不同或變化不一致，這表明奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生時乳清和血清中代謝物存在較大差異。依據(jù)乳清和血清的差異代謝物構(gòu)建了代謝網(wǎng)絡圖，闡明了奶牛產(chǎn)后發(fā)生卵巢靜止時機體的糖代謝相關(guān)代謝物含量降低，三羧酸循環(huán)反應減弱，脂動員相關(guān)代謝物含量升高，氨基酸代謝異常，為今后深入研究奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生機制和防治策略提供了新的方向。