陳 潔，吳利軍，陳夏冰，劉曉麗，金爾光，邵志勇，楊文海，何 斌，童偉文，劉 武*，楊漢春

(1.中國農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，北京 100193； 2.武漢市農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208；3.華中農業(yè)大學 動物醫(yī)學國家級實驗教學示范中心，武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的、無囊膜的、單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，基因組大小約1.7 kb[1-2]。目前，研究者根據(jù)PCV的致病性、抗原性和核苷酸序列將PCV分為PCV1、PCV2和PCV3三種基因型，其中PCV1無致病性，而PCV2和PCV3有較強的致病性[3-4]。其中由PCV2感染引起的豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus associated disease, PCVAD)是危害當今世界養(yǎng)豬生產的重要免疫抑制性疾病，包括一系列癥候群，如仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)等[5]。近年來，我國豬群中PCVAD的流行呈現(xiàn)范圍廣、感染率高、區(qū)域性流行顯著、存在隱性感染且感染率逐步升高、與其他病原混合感染等特點，使感染豬的病死率大大提高，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失[6-7]。目前，我國對PCVAD的防控主要依靠疫苗的免疫接種，但是由于病毒在長期的感染過程中極易發(fā)生變異和重組，并且PCVAD的發(fā)生常常伴隨著一種或多種病毒和細菌的混合感染[8-9]，僅僅依靠疫苗的免疫接種，防控效果并不十分理想。中草藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學的寶庫具有藥源豐富、藥物殘留低、毒副作用小、促進免疫重建等優(yōu)點，在畜禽病毒性疾病的防治上具有獨特的優(yōu)勢，同時也符合國家畜禽健康養(yǎng)殖的標準，對促進畜牧經濟持續(xù)健康的發(fā)展有十分重大的意義。

牛蒡子(FructusArctii)，始載于《名醫(yī)別錄》，為菊科兩年生草本植物牛蒡(AictiumlappaL.)的干燥成熟果實，味辛苦、性寒，歸肺胃二經，是一種常用的辛涼解表藥,具有疏散風熱、解毒透疹、利咽消腫等功效[10-11]。已有的研究表明，牛蒡子的主要活性成分牛蒡苷元(arctigenin, ACT)具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節(jié)等藥理作用[12-15]，能夠有效抑制人類免疫缺陷病毒、H1N1流感病毒和流行性乙腦病毒在體內外的轉錄與復制[16-18]。但是，關于ACT抗PCV2復制的研究鮮有報道。本實驗室前期的研究表明，15.6～62.5 μg·mL-1的ACT能夠顯著抑制PCV2在PK-15細胞上的復制，進一步的小鼠試驗表明，腹腔注射0.2 mg·kg-1的ACT能夠明顯抑制PCV2在小鼠肺、脾、腹股溝淋巴結組織內的復制[19]。本試驗在前期工作的基礎上，進一步評價ACT對人工感染PCV2仔豬體內病毒復制及組織病理學變化的影響,擬為進一步認識ACT抗PCV2的內在機制及未來抗PCV2中獸藥的研制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株

PCV2 WH株(GenBank登錄號FJ598044)，由華中農業(yè)大學微生物重點實驗室惠贈(8.5×1010copies·μL-1)，放置-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

ACT由實驗室自備，百分含量≥98%；DMEM培養(yǎng)基和PBS緩沖液購自GIBCO公司；病毒DNA提取試劑盒購自OMEGA公司；定量PCR擴增相關的試劑購自TaKaRa公司；蘇木素染液，伊紅染液，石蠟購自德國萊卡公司。

1.3 試驗動物及試驗設計

16頭30日齡仔豬(PCV2病原、抗體陰性，PRRSV、SFV病原陰性)隨機分成4組(n=4)：給藥組1、給藥組2、攻毒對照組和空白對照組。給藥組1和給藥組2分別按照20和50 μg·kg-1劑量給試驗仔豬肌內注射ACT，攻毒對照組和空白對照組注射生理鹽水，連續(xù)注射3 d；第三天肌注后，給藥組1、給藥組2和攻毒對照組進行PCV2攻毒，攻毒方式為肌內注射2.0 mL·頭-1+滴鼻2.0 mL·頭-1?？瞻讓φ战M用生理鹽水代替，之后各組恢復正常飼養(yǎng)。

給藥前(-2 d)、攻毒前(0 d)以及攻毒后7、14、21 d分別采集豬外周血，采用熒光定量PCR方法檢測PCV2核酸拷貝數(shù)；攻毒后21 d將試驗豬全部剖殺，采集腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、扁桃體、肺和脾組織進行PCV2核酸拷貝數(shù)檢測和組織病理學觀察。

1.4 組織樣品中病毒DNA的提取及定量檢測

常規(guī)處理組織樣品，提取病毒DNA，并按照實驗室前期建立的熒光定量PCR方法對組織樣品中的PCV2進行定量檢測[19]。

1.5 組織病理切片的制作及HE染色

取出多聚甲醛溶液中固定的組織，放入自動脫水機中進行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后，進行包埋，然后制成4 μm厚度的切片，應用全自動染色機進行HE染色。

1.6 病理學評分

打亂分組順序后對切片隨機編號，在鏡下分別從每頭仔豬的同一臟器的3個不同位點取材制作的病理切片中各取3個典型視野拍照。對每個臟器根據(jù)病變程度不同分別進行評分，分級標準如表1所示。評分時利用雙盲法對每張照片進行病理學評級打分，取3個結果的平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結 果

2.1 ACT對PCV2感染仔豬外周血中病毒載量的影響

如圖1所示，攻毒后7、14和21 d，攻毒對照組仔豬外周血中的病毒載量明顯上升，分別達到9.9×106、2.2×107和5.3×107copies·μL-1，與空白對照組比較，差異極顯著(P<0.01或P<0.001)。兩個給藥組在攻毒7、14和21 d外周血病毒載量相對于空白對照組也有不同程度升高，給藥組1(20 μg·kg-1)分別達1.4×104、8.2×103和1.0×105copies·μL-1，給藥組2(50 μg·kg-1)達7.2×103、1.1×104和5.8×104copies·μL-1，均顯著低于攻毒對照組(P<0.05或P<0.01)，兩個給藥組外周血病毒載量差異不顯著(P>0.05)。

2.2 ACT對PCV2感染仔豬組織中病毒載量的影響

攻毒后21 d將試驗仔豬全部剖殺，采集腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、扁桃體、肺和脾組織，對其中PCV2核酸拷貝數(shù)進行熒光定量PCR檢測。結果如圖2所示，攻毒對照組上述組織中病毒載量分別達到9.3×107、9.3×106、4.0×106、1.4×106和2.6×106copies·μL-1，極顯著高于空白對照組(P<0.01或P<0.001)；腹股溝淋巴結中，給藥組1(20 μg·kg-1)和給藥組2(50 μg·kg-1)的病毒載量分別為5.3×106和1.6×105copies·μL-1，相對于攻毒對照組不同程度降低，其中給藥組2極顯著低于攻毒對照組(P<0.001)和給藥組1(P<0.01)；腸系膜淋巴結中，給藥組1和給藥組2的病毒載量分別為2.6×105和8.4×104copies·μL-1，分別顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)低于攻毒對照組，兩個給藥組之間差異不顯著(P>0.05)；扁桃體和肺組織中，給藥組2的病毒載量均顯著低于攻毒對照組(P<0.05)，而給藥組1均未顯示對病毒復制的抑制作用；脾組織中，雖然給藥組2中病毒載量較攻毒對照組降低，但差異不顯著(P>0.05)，給藥組1未顯示病毒載量明顯下降(P>0.05)，兩個給藥組之間差異不顯著(P>0.05)。

表1組織病理學評分標準

Table1Histopathologicalclassificationstandard

組織名稱Tissue分值Score評分依據(jù)Scoring criteria肺 Lung0基本正常1肺泡壁輕度炎性細胞浸潤(淋巴細胞和巨噬細胞),肺泡壁未見增厚2明顯和廣泛的炎性細胞浸潤,多灶性肺泡壁輕度增厚(1～2倍)3嚴重的炎性細胞浸潤,多灶性(<25%)肺泡壁輕度至中度增厚(2～3倍)4嚴重的炎性細胞浸潤,多灶性(25%～50%)肺泡壁明顯增厚脾 Spleen0基本正常1輕度充血2明顯充血,多灶性出血,淋巴細胞輕度減少(<25%)3明顯充血,多灶性出血,淋巴細胞明顯減少(50%左右)4明顯充血,彌漫性出血,淋巴細胞嚴重減少(>75%)扁桃體 Tonsil0基本正常1輕度充血,多個隱窩上皮細胞輕度變性壞死,脫落2明顯充血,多個隱窩上皮細胞輕度變性壞死,脫落,淋巴細胞輕度減少(<25%)3明顯充血,多個隱窩上皮細胞明顯變性壞死,脫落,淋巴細胞明顯減少(50%左右)4明顯充血,彌漫性隱窩上皮細胞變性壞死,脫落,淋巴細胞嚴重減少(>75%)腸系膜淋巴結 0基本正常Mesenteric lymph nodes1輕度充血2明顯充血,淋巴細胞輕度減少(<25%)3明顯充血,淋巴細胞明顯減少(50%左右)4明顯充血,淋巴細胞嚴重減少(>75%)腹股溝淋巴結0基本正常Inguinal lymph nodes1輕度充血2明顯充血,淋巴細胞輕度減少(<25%)3明顯充血,淋巴細胞明顯減少(50%左右)4明顯充血,淋巴細胞嚴重減少(>75%)

*. P<0.05，**.P<0.01，***. P<0.001。下同*. P<0.05，**.P<0.01，***. P<0.001. The same as below圖1 ACT對PCV2感染仔豬外周血中病毒載量的影響Fig.1 Effect of ACT on the proliferation of PCV2 in piglet peripheral blood

A.腹股溝淋巴結；B.腸系膜淋巴結;C.扁桃體;D.肺;E.脾A. Inguinal lymph nodes; B. Mesenteric lymph nodes; C. Tonsilla; D. Lung; E. Spleen圖2 ACT對PCV2感染仔豬組織中病毒載量的影響Fig.2 qPCR detect the PCV2 copies number in the tissue of piglet

2.3 ACT對PCV2感染仔豬組織器官病理變化的影響

組織病理切片經HE染色后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組仔豬的各器官未見明顯病理變化。而攻毒對照組仔豬呈現(xiàn)：肺泡壁毛細血管明顯充血，肺泡腔內可見淋巴細胞、脫落的肺泡上皮細胞及巨噬細胞(圖3B)；脾嚴重充血，部分區(qū)域出血，淋巴小結內淋巴細胞減少(圖3F)；扁桃體黏膜下充血，淋巴小結內淋巴細胞明顯壞死(圖3J)；腸系膜淋巴結被膜下充血水腫，淋巴小結內淋巴細胞減少(圖3N)；腹股溝淋巴結被膜下及小梁周圍大量中性粒細胞浸潤，淋巴小結內少量的淋巴細胞壞死，伴中性粒細胞浸潤(圖3R)。

給藥組1(20 μg·kg-1)主要呈現(xiàn)部分肺小葉肺泡壁增厚，肺泡上皮細胞增生及充血(圖3C)；脾充血，部分區(qū)域出血(圖3G)；扁桃體(圖3K)、腸系膜淋巴結(圖3O)和腹股溝淋巴結(圖3S)呈現(xiàn)輕度水腫，淋巴小結內淋巴細胞減少。給藥組2(50 μg·kg-1)病理變化較給藥組1輕微，僅呈現(xiàn)肺泡壁輕度充血(圖3D)；扁桃體黏膜下水腫，少部分淋巴小結內淋巴細胞壞死，中性粒細胞浸潤(圖3L)；腸系膜淋巴結被膜下略顯水腫，少部分淋巴小結內淋巴細胞壞死(圖3P)；腹股溝淋巴結髓質內中性粒細胞浸潤(圖3T)；脾結構清晰，未發(fā)現(xiàn)明顯病變(圖3H)。結果表明兩個劑量給藥能不同程度減輕PCV2感染導致的仔豬肺、脾、扁桃體、腸系膜淋巴結及腹股溝淋巴結的病理變化。

2.4 ACT給藥后PCV2攻毒仔豬組織病理學評分

按“1.6”建立的組織病理學評分標準，對ACT影響下PCV2感染各組仔豬的肺、脾、扁桃體、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結病理切片進行評分并統(tǒng)計分析。結果如圖4所示，PCV2攻毒對照組仔豬與空白對照組相比在上述5個器官組織的病理學評分均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05或P<0.01)；20 μg·kg-1給藥組在肺、脾組織的病理學評分顯著低于攻毒對照組(P<0.05)；50 μg·kg-1給藥組在5個器官組織的病理學評分均顯著低于攻毒對照組(P<0.05)；兩個劑量給藥組在組織病理學評分上未顯示顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

研究者前期通過體內外試驗，發(fā)現(xiàn)ACT能夠有效抑制PCV2在PK-15細胞和小鼠體內的增殖[19]，而由于PCV2主要在豬群中流行并主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，導致被感染的豬產生免疫抑制和其他病原微生物的繼發(fā)感染[2,8-9]，因此，在仔豬水平上評價ACT對PCV2增殖的抑制效果，更能真實地反映ACT對PCV2感染引起的PCVAD是否具有防治效果。基于此，本研究在前期工作的基礎上進一步通過體內試驗評價ACT對人工感染PCV2仔豬體內病毒的復制及組織病理學影響。結果顯示，兩個劑量預先給藥均能顯著抑制PCV2攻毒后7、14、21 d仔豬外周血病毒載量；在攻毒后21 d將全部試驗仔豬剖殺，發(fā)現(xiàn)ACT能抑制PCV2在腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、扁桃體和肺組織中的增殖，且50 μg·kg-1給藥組在腹股溝淋巴結和扁桃體內的病毒載量顯著低于20 μg·kg-1給藥組。

A、E、I、M、Q分別對應空白對照組的肺、脾、扁桃體、腸系膜淋巴結和腹股溝淋巴結；B、F、J、N、R分別對應攻毒對照組的肺、脾、扁桃體、腸系膜淋巴結和腹股溝淋巴結；C、G、K、O、S分別對應給藥組1(20 μg·kg-1)的肺、脾、扁桃體、腸系膜淋巴結和腹股溝淋巴結；D、H、L、P、T分別對應給藥組2(50 μg·kg-1)的肺、脾、扁桃體、腸系膜淋巴結和腹股溝淋巴結。B：粗箭頭表示肺淤血，細箭頭表示肺泡腔內的炎性細胞；F：箭頭表示脾出血；J、N、R：圓形框表示淋巴小結的主要病變?yōu)樗[，淋巴細胞和網狀細胞的變性壞死A, E, I, M, Q correspond to the lung, spleen,tonsilla, mesenteric lymph nodes, inguinal lymph nodes in control group; B, F, J, N correspond to above tissue infected by PCV2; C, G, K, O, S correspond to above tissue treated by ACT at 20 μg·kg-1; D, H, L, P, T correspond to above tissue treated by ACT at 50 μg·kg-1. B: The coarse arrows indicate lung congestion, the fine arrows indicate inflammatory cells; F: The arrow indicates splenic hemorrhage; J, N, R: The round boxes indicate edema, degeneration, necrosis of lymphocytes and histolytic cells圖3 ACT給藥后PCV2攻毒仔豬組織病理學變化(200×倍)Fig.3 Histological results inpigiet tissue of ACT deal with piglet infected by PCV2(200×)

A. 肺；B. 脾；C. 扁桃體；D. 腸系膜淋巴結；E. 腹股溝淋巴結A. Lung; B. Spleen; C. Tonsilla; D. Mesenteric lymph nodes; E. Inguinal lymph nodes圖4 ACT給藥后PCV2攻毒仔豬組織病理學評分Fig.4 Histopathological score in piglet tissue of ACT deal with piglet infected by PCV2

PCV2感染后引起豬的病理組織學病變主要表現(xiàn)在淋巴組織、肺、脾和扁桃體等。一般可見淋巴細胞缺失、巨噬細胞浸潤并見多核巨細胞和上皮樣細胞，淋巴竇擴張，其中充滿單核細胞或其他的炎性細胞。有時也能觀察到淋巴竇內多灶性的凝固性壞死[20-22]。本研究的組織病理學觀察結果顯示，攻毒組各組織均呈現(xiàn)以炎性細胞浸潤為主的病理變化，這與Chae[22]的報道相似；而給藥后，上述器官組織的病理變化不同程度減輕；同時，對ACT影響下PCV2感染仔豬的肺、脾、扁桃體、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結病理切片進行評分，發(fā)現(xiàn)20 μg·kg-1給藥組在肺、脾組織的病理學評分顯著低于攻毒對照組(P<0.05)；50 μg·kg-1給藥組在肺、脾、扁桃體、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結5個組織的病理學評分均顯著低于攻毒對照組(P<0.05)；兩個劑量給藥組在組織病理學評分上未顯示顯著差異(P>0.05)。組織病理學評分結果與仔豬扁桃體、肺、脾組織內的PCV2載量并不完全一致，考慮到熒光定量PCR方法檢測的是PCV2核酸拷貝數(shù)，部分已失去活性的病毒仍被檢出，計入病毒載量，提示我們分析評價藥物作用時必須結合多角度結果進行綜合分析。

4 結 論

ACT能夠有效抑制PCV2在仔豬外周血及腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、扁桃體、肺、脾組織內的復制，并能減輕由PCV2感染引起的病理變化，其具體作用機制需要進一步探究。