王聰 黃幼生 蔡仁桑

1海口市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科（?？?570000）；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科（海口 570102）

肺癌作為全世界最常見、發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率更是達(dá)到49.60/10萬(wàn)人，位于惡性腫瘤首位［1］。而非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）作為肺癌最常見的組織學(xué)類型，約占肺癌總數(shù)的80%以上，相對(duì)于其他種類的肺癌，其增殖、遷移等相對(duì)較快，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，其5年生存率較低［2］。MicroRNA（miRNA）是長(zhǎng)約 22 nt的非編碼RNA，能與目標(biāo)靶基因特異性結(jié)合，介導(dǎo)生物信號(hào)的調(diào)節(jié)。當(dāng)前研究已表明，miRNA不僅參與調(diào)控了細(xì)胞分化、增殖、遷移以及存活等過(guò)程，而且還與糖尿病、心衰以及癌癥在內(nèi)的諸多病理過(guò)程有關(guān)［3-4］。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-760在胃癌、乳腺癌、直腸癌等多種癌癥中呈低水平表達(dá)［5-9］，提示miR-760可能在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但miR-760是否能作為抑癌基因在NSCLC增殖、遷移等過(guò)程發(fā)揮作用尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。因此，本課題旨在闡明miR-760在NSCLC增殖、遷移和侵襲中的作用及其具體機(jī)制，為NSCLC的治療及研究提供新的理論依據(jù)及思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑及細(xì)胞株人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞源自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），miR-760 mimics、miRNA inhibitors、miRNA mimics control和miRNA inhibitors control均由廣州銳博科技有限公司構(gòu)建?？贵wintegrin β3、cyclin D1、GAPDH均來(lái)自cell signaling公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體來(lái)自北京康普森生物技術(shù)有限公司，miRNA提取試劑盒來(lái)自天根生化科技（北京）有限公司，Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit試劑盒來(lái)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，Cy-QUANT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自sigma公司；RPMI 1640、雙抗來(lái)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)BS來(lái)自中國(guó)四季青公司，其他分析純?cè)噭┚鶠閲?guó)產(chǎn)。

1.2肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)及miR-760轉(zhuǎn)染復(fù)蘇A549 細(xì)胞，置于10%FBS+RPMI1640、5%CO2、37℃貼壁培養(yǎng)，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)皿80%時(shí)，消化傳代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，然后進(jìn)行分組。轉(zhuǎn)染細(xì)胞（對(duì)照組）：加入相應(yīng)體積PBS；A549-mimics control組（miRNA過(guò)表達(dá)對(duì)照組）：加入miRNA mimics control，轉(zhuǎn)染濃度50 nmoL；A549-inhibitor control組（miRNA抑制對(duì)照組）：加入miRNA inhibitors control，轉(zhuǎn)染濃度 100 nmol；A549-760（+）組（miR-760過(guò)表達(dá)組）：加入miR-760 mimics，轉(zhuǎn)染濃度50 nmoL；A549-760（-）組（miR-760抑制組）：加入miRNA inhibitors，轉(zhuǎn)染濃度100 nmoL，加入相應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑后，按照轉(zhuǎn)染試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h，PBS洗滌，換新培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3MTT細(xì)胞活力與CyQUANT細(xì)胞增殖檢測(cè)MTT細(xì)胞活力檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照5×103cell/孔種植于96孔板中，每組設(shè)置復(fù)孔8個(gè)，共鋪設(shè)5板。置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)12 h，加入相應(yīng)miRNA，轉(zhuǎn)染24 h，然后換液（此時(shí)即為0 h）。繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，然后吸棄培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液100 μL和5 mg/mL的MTT溶液 20 μL，孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩孵育10 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492 nm測(cè)定光吸收值。CyQUANT細(xì)胞增殖檢測(cè)：與MTT細(xì)胞活力檢測(cè)前面步驟相同，細(xì)胞分組培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，吸棄培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板于70℃冷凍1 h以上。然后于室溫化凍，然后加入200 μL的CYQUANTGR染液/細(xì)胞裂解液，渦旋混勻，避光室溫孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值（激發(fā)光485 nm，發(fā)射光535 nm）。

1.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)6孔板背面用marker筆每隔1 cm劃水平線，每孔劃線至少3條。將control，A549-760（+），A549-760（-），A549-mimics control，A549-inhibitor control各組細(xì)胞以5×104cell/孔密度種植，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，吸棄培養(yǎng)液。使用200 μL槍頭垂直于背面水平線在6孔板內(nèi)表面劃痕，每孔劃5條，PBS漂洗，加入2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，并于劃痕與橫線交叉處拍照記錄。然后繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，以同樣放大倍數(shù)拍照，比較各組細(xì)胞遷移率。

1.5Matrigel transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)冷移液槍頭吸取40 μL的 Matrigel，均勻加入Transwell小室內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h。然后將各組細(xì)胞以2×105cell/孔種植于小室內(nèi)，然后加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液150 μL。在孔板內(nèi)加入含 20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液 600 μL，之后將Transwell小室放入板內(nèi)培養(yǎng)。48 h之后取出小室，輕輕擦去Matrigel膠及膠上未遷出細(xì)胞，PBS洗滌，結(jié)晶紫染色，隨機(jī)選取4個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.6miRNA quantitative real-time PCR測(cè)定通過(guò)miRNA提取試劑盒提取組織及細(xì)胞miRNA，按照Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及定量分析。結(jié)果通過(guò)2-△△CT相對(duì)定量法進(jìn)行分析（miR-760 forward，5′-TAT TGCTTAAGAATACGCGTAG-3′and reverse 5′-AAC TCCAGCAGGACCATGTGAT-3′）。

1.7Western blot法檢測(cè)integrin β3、cyclin D1蛋白表達(dá)提取蛋白樣品后，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按照30 μg/每通道上樣量，130 V進(jìn)行SDS-PEGE電泳，然后恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將其放置于脫脂奶粉（50 g/L）溶液中封閉2 h。然后一抗（1∶1 000 integrin β3和cyclin D1）4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌，ECL發(fā)光。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本論文所有數(shù)據(jù)以±s表示，每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次以上重復(fù)，使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR法檢測(cè)miR-760表達(dá)差異qRTPCR檢測(cè)miR-760基因在NSCLC細(xì)胞系（A549，SPC-A1，H1299，H23）及癌旁組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：miR-760 mRNA在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于癌旁組織（圖1）。

2.2miRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞鑒定與Control組和A549-mimics control相比，A549-760（+）組（過(guò)表達(dá)組）細(xì)胞miR-760的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加；與control組和A549-inhibitor control相比，而A549-760（-）組（抑制組）miR-760表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P ＜0.05）；其次與 control組細(xì)胞相比，A549-mimics control和A549-inhibitor control組細(xì)胞miR-760 mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-760基因在NSCLC細(xì)胞系及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-760 in the NSCLC cell lines and the adjacent normal tissues was detected by qRT-PCR

圖2 qRT-PCR檢測(cè)miR-760表達(dá)Fig.2 Expression of miR-760 was measured by qRT-PCR

2.3 miR-760對(duì)細(xì)胞活力及增殖能力的影響MTT和CyQUANT試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞在96 h內(nèi)的細(xì)胞活力與增殖能力。結(jié)果顯示：A549-miR-760（-）組在培養(yǎng)48 h后，其細(xì)胞活力及增值率較對(duì)照組明顯增高（P＜0.05），而A549-760（+）組在培養(yǎng)72 h后呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其細(xì)胞活力降低（P＜0.05），增殖減慢（P＜0.05）（圖3）。

圖3 MTT和CyQUANT檢測(cè)細(xì)胞活力及增殖Fig.3 MTT and CyQUANT assay for assessing cell metabolic activity and proliferation

2.4 miR-760對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響Matrigel-Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-760對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響，結(jié)果表明：A549-760（+）組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)量與Control組和A549-mimics Control相比，顯著減少（P ＜ 0.05），而 A549-760（-）組與control組和A549-inhibitor control相比穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)量則明顯增加（P＜0.05）；A549-mimics Control和A549-inhibitor control組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

2.5 miR-760對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)miR-760對(duì)A549遷移能力的影響，結(jié)果顯示：同Control組相比，A549-760（+）組細(xì)胞遷移能力明顯減弱，而A549-760（-）組遷移能力卻顯著增強(qiáng)A549-mimics Control和A549-inhibitor control組細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（圖5）。

2.6 miR-760對(duì)integrin β3和cyclin D1的影響檢測(cè)integrin β3和cyclin D1基因在NSCLC細(xì)胞系（A549，SPC-A1，H1299，H23）及癌旁組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：integrin β3和cyclin D1在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.005）。而且，A549-760（+）細(xì)胞integrin β3和cyclin D1蛋白的表達(dá)最低，A549-760（-）細(xì)胞integrin β3和cyclin D1蛋白的表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6，P＜0.005）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺癌患者其癌細(xì)胞未發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，5年生存率可達(dá)50%，但是如若患者癌細(xì)胞已經(jīng)局部浸潤(rùn)或者發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率會(huì)直接下降達(dá)到20%，而發(fā)生癌癥遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者其5年生存率更是低至4%［10-11］，由此可見細(xì)胞的快速侵襲、增殖和遷移效率是影響肺癌患者預(yù)后效果，甚至進(jìn)一步導(dǎo)致其死亡的主要因素［12］。而NSCLC作為肺癌的主要類型，因增殖轉(zhuǎn)移較快，多數(shù)患者在就診時(shí)其癌細(xì)胞就已浸潤(rùn)周圍的正常組織。因此，找尋并探索抑制NSCLC侵襲、增殖和遷移的方法與機(jī)制，是目前NSCLC的臨床治療急需解決的問(wèn)題。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-760抑制細(xì)胞遷移Fig.5 miR-760 overexpression suppressed the cell migration

圖6 過(guò)表達(dá)miR-760抑制integrin β3和cyclin D1的表達(dá)Fig.6 Overexpression of miR-760 inhibited the integrin β3 and cyclin D1 expression

miRNA被發(fā)現(xiàn)可以與靶基因mRNA進(jìn)行不同程度的特異性結(jié)合，促使靶基因的抑制與降解，參與調(diào)控了多種生物學(xué)過(guò)程，如組織分化、衰老死亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展等［13］。而且目前已有研究發(fā)現(xiàn)：miRNA在多種癌癥中存在差異，并具有抑癌基因作用。miR-760相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中過(guò)表達(dá)miR-760可以抑制乳腺癌的增殖和遷移［7］。除此之外，KIM等［9］研究表明結(jié)腸直腸癌患者血液miR-760含量明顯低于健康患者。但miR-760在肺癌，特別是在NSCLC中增殖、遷移和侵襲中的作用尚不清楚?；诖?，筆者探索了miR-760在NSCLC增殖、遷移和侵襲中的作用及其調(diào)控機(jī)制，為其的臨床治療提供新思路。

本研究對(duì)NSCLC細(xì)胞系及癌旁組織中的miR-760基因表達(dá)進(jìn)行差異檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-760的表達(dá)在NSCLC細(xì)胞系中顯著低于癌旁組織，提示miR-760可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。筆者在體外建立過(guò)表達(dá)和低表達(dá)miR-760的A549細(xì)胞，進(jìn)而明確miR-760基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖遷移等生物學(xué)能力的影響。采用MTT、CyQUANT、細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)首先明確了miR-760在A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲作用。結(jié)果顯示，miR-760負(fù)性調(diào)節(jié)了A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，過(guò)表達(dá)miR-760將抑制A549細(xì)胞其增殖、遷移及侵襲能力，抑制miR-760表達(dá)則增強(qiáng)A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。Integrin β3作為一類介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境物理連接和信息連接的跨膜受體，控制著細(xì)胞的粘附、運(yùn)動(dòng)、遷移、增殖和凋亡等基本細(xì)胞生物學(xué)功能，與腫瘤等重大疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-760，能夠A549細(xì)胞抑制Integrin β3表達(dá)及周期蛋白Cyclin D1表達(dá)；而抑制miR-760表達(dá)則上調(diào)Integrin β3及周期蛋白Cyclin D1。

總之，本研究證明miR-760可能是通過(guò)抑制integrin β3表達(dá)，對(duì)NSCLC的增殖、遷移及侵襲具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這將為肺癌患者的臨床治療提供了新的靶點(diǎn)與思路。