羅招凡 鄭上游 趙書琴

1中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣東深圳 518017）；2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院膽胰外科（廣州 510120）

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、惡性程度極高的消化道惡性腫瘤，易局部復(fù)發(fā)，肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，90%患者死于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，近年來其發(fā)病率逐年升高［1-2］。LI等［3］通過全基因組相關(guān)性研究（GWAS）鑒定出肝細(xì)胞核因子1α（HNF1α）為胰腺癌相關(guān)易感基因，但其具體作用未明。肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factors，HNFs）主要表達(dá)于肝臟、腎臟、胰腺等組織，是一類在肝臟優(yōu)勢(shì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控肝臟、胰腺等組織特異基因的表達(dá)。近來HOSKINS等［4］通過在胰腺癌細(xì)胞株（PANC-1、MIAPaCa-2）中過表達(dá)HNF1α，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)受抑、凋亡增加，認(rèn)為HNF1α在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著抑癌作用。本研究擬在此基礎(chǔ)上，利用siRNA技術(shù)抑制HNF1α的表達(dá)，研究其對(duì)胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3增殖、遷移的影響，擬進(jìn)一步明確HNF1α在胰腺癌中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與主要試劑BxPC-3細(xì)胞株購自ATCC（American Type Culture Collection），本室保存。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%Trysin-EDTA、Trizol及Invitrogen GoldScript一步法RT-PCR試劑盒（美國Life公司）；HNF1α siRNA及陰性對(duì)照siRNA、siPORTNeoFX轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Ambion公司）；DNA Marker（東盛生物）；第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR?Fast qPCR Mix（TaKaRa生物有限公司）；HNF1α抗體（Abcam）；β-actin抗體（美國Sigma公司）；引物（廣州艾基生物有限公司）；Cell Titer-GIo發(fā)光試劑盒（美國Promega公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（美國BD公司）；Transwell小室（美國BD公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)BxPC-3細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3siRNA轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞株根據(jù)GeneBank HNF1α基因已知序列（Accession No.NM_000545），已確證的HNF1α siRNA由Ambion公司提供，HNF1α siRNA正義鏈：5′-CAGUGAGACUGCAGAAGUAtt-3′。實(shí)驗(yàn)分為3組，設(shè)為空白對(duì)照組（mock group，未轉(zhuǎn)染siRNA）、陰性對(duì)照組（control group，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）和HNF1α沉默組（HNF1α siRNA group，轉(zhuǎn)染HNF1α siRNA）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，以1.0×105個(gè)/孔鋪于6孔板，分別加入轉(zhuǎn)染液、HNF1α siRNA、陰性對(duì)照siRNA。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4RNA的提取及實(shí)時(shí)定量RT-PCR轉(zhuǎn)染48 h后，TRIZOL提取總RNA，運(yùn)用第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)體系：Oligo dT Primer 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，模板RNA 5 μL，ddH2O 3 μL，65 ℃保溫5 min 后，冰上迅速冷卻。在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5× Prime Script II Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Prime Script II RTase 1 μL，RNase free ddH2O 4.5 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 45 min，95 ℃5 min后，冰上冷卻。Real-time PCR引物：HNF1α-F：CAGGGAGGGCTGATTGAAGA；HNF1α-R：CCCCACTTGAAACGGT；GAPDH-F：ACCCAGAAGACTGTGGATGG；GAPDH-R：CAGTGAGCTTCCCGTTCAG。運(yùn)用Takara的SYBR?Fast qPCR Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為25 μL，SYBR Fast qPCR Mix（2x）12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，運(yùn)用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5Western blot實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染72 h后，收集6孔板細(xì)胞，加200 μL裂解液，按Western印跡操作流程進(jìn)行檢測(cè)，用Image-Quant分析軟件測(cè)定結(jié)果中條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)BxPC-3細(xì)胞消化稀釋，按104個(gè)/孔接種于96孔板，同時(shí)設(shè)空白調(diào)零孔，每組設(shè)置5個(gè)平行復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h后，每孔加入等體積Cell Titer-GIo試劑，檢測(cè)發(fā)光值。

1.7細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染72 h后，使用不含EDTA的胰酶消化BxPC-3細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，1×Binding buffer懸浮細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取100 μL懸液（1×105個(gè)細(xì)胞）至5 mL試管，加入5 μL FITC AnnexinV及5 μL PI，混合后室溫避光孵育15 min，每管加入400 μL 1 × Binding buffer，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染48 h后，將BxPC-3細(xì)胞消化，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至5×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，取200 μL細(xì)胞懸液加入transwell小室上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 h后，取出上室，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞。0.025%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌3次，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)用不同批次細(xì)胞重復(fù)3次以上，采用SPSS 17.0軟件，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNF1α siRNA對(duì)BxPC-3細(xì)胞HNF1α mRNA及蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染了靶向HNF1α siRNA（siRNA）48 h后，與陰性對(duì)照組比較，BxPC-3細(xì)胞HNF1α mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)，轉(zhuǎn)染72 h后Western blot結(jié)果顯示，HNF1α siRNA敲低組HNF1α蛋白表達(dá)顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而兩對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2Cell Titer-GIo發(fā)光法檢測(cè)BxPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)情況采用Cell Titer-GIo發(fā)光法分別于轉(zhuǎn)染HNF1α siRNA 后12、24、48、72 h檢測(cè)BxPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，HNF1α敲低組BxPC-3細(xì)胞的增殖活力明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而兩對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)BxPC-3細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染72 h后，采用AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組BxPC-3細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，HNF1α敲低組（siRNA）細(xì)胞凋亡率顯著低于陰性對(duì)照組（2.19%vs.48.37%，P＜0.05），而兩對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖1 各組BxPC-3細(xì)胞HNF1α mRNA及蛋白表達(dá)水平Fig.1 Expression of HNF1α mRNA and protein in each group of BxPC-3 cells

圖2 HNF1α siRNA對(duì)BxPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of HNF1α siRNA on the growth of BxPC-3 cells

圖3 HNF1α siRNA對(duì)BxPC-3細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of HNF1α siRNA on the apoptosis of BxPC-3cells

2.4 Transwell法檢測(cè)BxPC-3細(xì)胞遷移能力轉(zhuǎn)染了特異HNF1α siRNA后，transwell結(jié)果顯示，HNF1α敲低組BxPC-3細(xì)胞遷移能力顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而兩對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖4。

3 討論

HNFs是一類在肝臟優(yōu)勢(shì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，包括HNF1、3、4、6、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白和D-結(jié)合蛋白，其中HNF1包括HNF1α、HNF1β兩個(gè)成員，HNF1α又名LFB1/TCF1，是一個(gè)含有變異同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，它定位于人染色體12q24.2，表達(dá)于肝、腎、腸和胰腺組織中，是肝臟富集轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，可調(diào)控多種組織特異基因的表達(dá)［5］。

圖4 HNF1α siRNA對(duì)BxPC-3細(xì)胞遷移的影響（×40）Fig.4 Effect of HNF1α siRNA on the migration of BxPC-3 cells（× 40）

已有研究顯示HNF1α與肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］，且是維系肝細(xì)胞分化表型的重要轉(zhuǎn)錄因子［5］，在高分化的肝癌細(xì)胞中，HNF1α的表達(dá)水平高，反之表達(dá)減低，在去分化的肝細(xì)胞中回轉(zhuǎn)HNF1α能夠恢復(fù)肝細(xì)胞的分化表型［7］。PELLETIER等［8-9］發(fā)現(xiàn)HNF1α在HCC細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)，且HNF1α表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)上皮來源的HCC細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。以上研究表明HNF1α在肝細(xì)胞癌中是一種抑癌基因。然而，在胰腺癌中HNF1α表達(dá)減低或缺失的作用不是很明確，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道有限。

本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，與胰腺癌旁的正常組織相比，胰腺癌組織中HNF1α表達(dá)顯著降低［10］，HNF1α mRNA相對(duì)表達(dá)量降至正常對(duì)照的0.44，蛋白水平也相應(yīng)降低，約為正常對(duì)照的一半，提示其可能參與了胰腺癌的發(fā)病過程。本研究通過siRNA技術(shù)抑制BxPC-3細(xì)胞HNF1α表達(dá)，以探討HNF1α對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和遷移的影響。結(jié)果顯示，下調(diào)HNF1α表達(dá)后可顯著促進(jìn)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞遷移。這也與ZENG等［11］報(bào)道的過表達(dá)HNF1α幾乎可完全抑制肝癌細(xì)胞株Hep3B、Huh7在裸鼠體內(nèi)的成瘤性結(jié)果相類似。另外KRüTZFELDT等［12］也發(fā)現(xiàn)，在HNF1α基因敲除小鼠中，肝組織miR-192/194表達(dá)顯著下調(diào)，其下游靶基因Fzd6表達(dá)顯著上調(diào)，提示HNF1α可能通過調(diào)控miR-194及其靶基因Fzd6表達(dá)而抑制HCC發(fā)生。HELLERBRAND等［13］也發(fā)現(xiàn)HNF1α在HCC細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)，并與抑癌基因MIA2表達(dá)下調(diào)顯著相關(guān)，恢復(fù)HNF1α表達(dá)可重新誘導(dǎo)MIA2表達(dá)，繼而可顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖、侵襲能力以及移植瘤的生長(zhǎng)、侵襲，表明HNF1α表達(dá)缺失可引發(fā)HCC。與以上結(jié)果一致，HOSKINS等［4］通過在胰腺癌細(xì)胞株中過表達(dá)HNF1α，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，凋亡增加，提示HNF1α也可能在胰腺癌癌發(fā)病中起著重要的抑癌作用。

綜上所述，采用HNF1α siRNA可以成功敲低胰腺癌BxPC-3細(xì)胞中HNF1α基因的表達(dá)，HNF1α基因敲低后胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖和遷移能力均上升，細(xì)胞凋亡減低。這一結(jié)果可能為臨床治療胰腺癌的轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)新的干預(yù)靶點(diǎn)。但HNF1α對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移影響的機(jī)制尚不清楚，本課題組將繼續(xù)深入探討其具體調(diào)控機(jī)制，為胰腺癌的分子靶向治療提供更加科學(xué)的理論依據(jù)。