潘春鵬， 李 峰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科，上海 200433

賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1, LSD1/KDM1A)作為胺氧化酶家族成員，是最早被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，可通過除去底物或組蛋白結(jié)構(gòu)以外的甲基調(diào)控基因表達，參與細胞的增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)過程，因其在非小細胞肺癌、前列腺癌和舌癌等多種腫瘤組織或細胞中異常高表達，具有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用而備受學(xué)者們的關(guān)注[1-3]。已有研究[4-5]證實，KDM1A在結(jié)直腸癌中異常高表達，發(fā)揮著促進腫瘤細胞生長的作用，但其具體的作用機制尚不明確。近年來研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，KDM1A可負向調(diào)控AKT信號通路抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其有無通過介導(dǎo)AKT信號通路參與結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲過程尚未可知。因此，本研究通過體外干擾結(jié)直腸癌HCT15細胞中KDM1A表達，探討其對細胞增殖、侵襲和AKT信號通路的影響，以期從KDM1A負向調(diào)控AKT角度揭示其對結(jié)直腸癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑、KDM1A小干擾RNA(si-KDM1A)和陰性對照(si-NC)購自美國Invitrogen公司。Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素和RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，MTT試劑購自美國Simga公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和蛋白提取試劑盒購自碧云天生物公司，化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Bioworld公司，PI周期試劑盒購自聯(lián)科生物公司，RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司，GAPDH抗體、p21抗體、Cyclin D1抗體、MMP-2抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司，KDM1A抗體購自美國R&D公司。Transwell小室購自美國Millipore公司，CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司， 倒置顯微鏡購自重慶光學(xué)儀器廠，酶標(biāo)儀購自天津開元生物公司，流式細胞儀購自美國BD公司。凝膠成像分析系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2細胞培養(yǎng)及處理人結(jié)直腸癌HCT15細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。以含有質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基及體積分數(shù)為5%的CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)條件的孵箱培養(yǎng)，定期觀察細胞生長情況，每2 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細胞匯合度約為85%時，加入胰蛋白酶消化傳代。收集長勢良好的對數(shù)生長期細胞，以每孔5×105個細胞接種至6孔細胞板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)過夜。次日，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟將20 μmol/L si-KDM1A轉(zhuǎn)染至HCT15細胞，作為si-KDM1A組，而轉(zhuǎn)染si-NC的細胞作為si-NC組。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，于孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，待培養(yǎng)48 h后收集細胞用以RT-PCR和Western blotting檢測。

1.3RT-PCR檢測采用Trizol法提取si-NC組和si-KDM1A組細胞的總RNA。依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，將產(chǎn)物上PCR儀進行擴增。擴增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán); 95 ℃變性5 s，40個循環(huán)；58 ℃退火30 s，40個循環(huán)。根據(jù)大連寶生物公司合成的引物序列：KDM1A：上游序列5′-GGCAGCAGCTCGACAGTTACAA-3′，下游序列5′-TACCACCATGGCTGGAAGATCA-3′；內(nèi)參GAPDH：上游序列5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游序列5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，以 2-ΔΔCt法計算si-NC組和si-KDM1A組細胞中KDM1A mRNA的相對表達量。

1.4MTT檢測收集轉(zhuǎn)染后的si-NC組和si-KDM1A組細胞，以每孔3×105個接種至96孔細胞板上，每組設(shè)6個平行孔。于孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24～72 h，培養(yǎng)至所需時間后，加入 MTT溶液(質(zhì)量濃度為5 g/L，體積20 μl)作用4 h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入二甲基亞楓(體積150 μl)反應(yīng)10 min。以酶標(biāo)儀檢測各組細胞在490 nm處的光密度值(OD值)。

1.5FCM檢測收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-NC組和si-KDM1A組細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，以1 500 r/min離心10 min。磷酸緩沖液洗滌后，加入預(yù)冷的質(zhì)量濃度為700 g/L的乙醇4 ℃下固定24 h。洗滌后，加入500 μl碘化丙啶37 ℃下避光染色15 min。上流式細胞儀檢測各組細胞的周期變化。

1.6Transwell小室檢測首先在Transwell小室鋪上基質(zhì)膠，常溫下融合2 h。其次，將轉(zhuǎn)染48 h后的si-NC組和si-KDM1A組細胞加胰蛋白酶消化后，離心棄上清，加入無血清的培養(yǎng)基制備濃度為1×105ml-1的細胞懸液。取Transwell小室，于上室中每孔接種100 μl制備的細胞懸液，于下室中加入含血清的培養(yǎng)基，放入孵箱中培養(yǎng)。24 h后取出底膜，小心拭去上室中未穿過的細胞，冰甲醇固定10 min下室中的細胞，并以結(jié)晶紫染色20 min。隨機選取6個視野，于倒置顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.7Westernblotting檢測采用總蛋白提取試劑盒獲取si-NC組和si-KDM1A組細胞的總蛋白，經(jīng)BCA法對所提總蛋白定量后，取變性蛋白50 μg行SDS-PAGE電泳，以80 V電壓電泳至溴酚藍跑至分離膠后，更換200 V電壓電泳，待溴酚藍到達分離膠底部時結(jié)束電泳。采用轉(zhuǎn)膜儀以250 mA電流將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上。再經(jīng)去脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉1 h后，加入1∶1 000倍稀釋的KDM1A抗體，4 ℃反應(yīng)過夜。次日，加入1∶3 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫反應(yīng)1 h。封閉液洗膜后，在暗室內(nèi)加入ECL試劑曝光拍照，采用Iamge J軟件以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白的灰度值比表示目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1si-KDM1A對結(jié)直腸癌HCT15細胞中KDM1AmRNA和蛋白表達的影響將si-KDM1A轉(zhuǎn)染至HCT15細胞48 h后，RT-PCR和Western blotting檢測其干擾效果，結(jié)果如圖1所示。KDM1A mRNA和蛋白在si-KDM1A組中的相對表達量分別為0.24±0.01和0.31±0.02，與si-NC組1.00±0.06和0.86±0.05相比均明顯降低(t1=5.422，P=0.006；t2=3.105，P=0.036)。si-KDM1A成功下調(diào)結(jié)直腸癌HCT15細胞中KDM1A的表達。

2.2下調(diào)KDM1A表達對結(jié)直腸癌HCT15細胞增殖和細胞周期的影響MTT法檢測si-NC組和si-KDM1A組細胞的增殖能力，結(jié)果見圖2A。24、48和72 h作用時間下，si-KDM1A組細胞的OD值分別為0.52±0.02、0.60±0.04和0.67±0.05，而si-NC組細胞的OD值分別為0.65±0.05、0.78±0.06和0.89±0.06，si-KDM1A組細胞的增殖能力較si-NC組明顯降低(t1=4.181，P=0.014；t2=4.326，P=0.012；t3=4.879，P=0.008)。流式細胞儀檢測兩組細胞轉(zhuǎn)染48 h后的周期分布情況，結(jié)果見圖2B。與si-NC組G1期(58.68±6.05)%、S期(24.52±1.63)%和G2期(16.76±1.55)%相比，si-KDM1A組細胞在G1期所占百分比(76.35±5.29)%升高(t=3.808，P=0.019)，而S期(17.86±1.16)%和G2期(5.78±0.33)%均明顯降低(t1=5.766，P=0.005；t2=12.001，P=0.000)。猜測，下調(diào)KDM1A表達可能通過誘導(dǎo)細胞阻滯于G1期抑制HCT15細胞增殖。

注：與si-NC組相比，*P<0.05。

圖1si-KDM1A對HCT15細胞中KDM1A的干擾效果

A：Western blotting檢測結(jié)果；B：RT-PCR檢測結(jié)果

Fig1Theinterferenceeffectofsi-KDM1AonKDM1AinHCT15cellsA: the result of Western blotting detection; B: the result of RT-PCR test

注：與si-NC組相比，*P<0.05。圖2 KDM1A基因?qū)Y(jié)直腸癌HCT15細胞增殖和細胞周期的影響 A：各組細胞的OD值；B：各組細胞的周期分布Fig 2 The effect of KDM1A gene on the proliferation and cell cycle of colorectal cancer HCT15 cells A: the OD value of cells in each group; B: the cell cycle distribution

2.3下調(diào)KDM1A表達對結(jié)直腸癌HCT15細胞侵襲能力的影響轉(zhuǎn)染48 h后，采用Transwell小室檢測HCT15細胞的侵襲能力，結(jié)果見圖3。si-KDM1A組細胞的侵襲細胞數(shù)從si-NC組的(126.55±10.30)個降為(81.75±6.85)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.853，P=0.004)?？梢?，下調(diào)KDM1A表達可明顯抑制HCT15細胞的侵襲能力。

注：與si-NC組相比，*P<0.05。圖3 KDM1A基因?qū)Y(jié)直腸癌HCT15細胞侵襲能力的影響Fig 3 The influence of KDM1A gene on the invasive ability of colorectal cancer HCT15 cells

2.4下調(diào)KDM1A表達對AKT信號通路相關(guān)蛋白p21、CyclinD1、MMP-2和p-AKT表達的影響采用Western blotting進一步檢測HCT15細胞中AKT信號通路相關(guān)蛋白p21、 Cyclin D1、MMP-2和p-AKT的表達情況，結(jié)果見圖4。轉(zhuǎn)染si-KDM1A后，p21蛋白的相對表達量從si-NC組的0.31±0.02升高為0.63±0.04，而Cyclin D1、MMP-2和p-AKT蛋白的相對表達量分別從1.18±0.07、0.76±0.05、0.52±0.03下降為0.48±0.03、0.37±0.03、0.22±0.01，經(jīng)獨立樣本t檢驗分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t1=12.394，P=0.000；t2=15.920，P=0.000；t3=11.585，P=0.000；t4=16.432，P=0.000)。結(jié)果表明，KDM1A基因可通過抑制AKT信號通路參與結(jié)直腸癌HCT15細胞的增殖和侵襲。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其排名居全世界惡性腫瘤的第3位。據(jù)統(tǒng)計[8-9]，世界上每年因結(jié)直腸癌死亡的人數(shù)達60萬，每年新增的發(fā)病人數(shù)高達120萬，且其發(fā)病率仍呈上升趨勢。癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個受多種基因和信號通路共同調(diào)控的復(fù)雜過程，其治療一直是一個世界性難題。探討結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機制對結(jié)直腸癌的治療和預(yù)后具有重要意義。KDM1A是一個位于人類1號染色體的保守基因，因其特殊的去甲基化功能和多種染色質(zhì)調(diào)節(jié)功能，可調(diào)控多種基因的表達，進而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。如KDM1A可通過下調(diào)KLF2基因的表達抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，通過調(diào)控E2F基因參與口腔癌細胞的增殖[10-11]；同時還通過抑制PI3K/Akt信號活性抑制雌激素驅(qū)動的子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，并誘導(dǎo)G1細胞阻滯和細胞凋亡[6]。已有研究[5]證實,沉默KDM1A表達可抑制結(jié)直腸癌SW620細胞的增殖和侵襲，但其具體的調(diào)控機制還不明確。本研究通過體外細胞實驗在結(jié)直腸癌HCT15細胞中成功下調(diào)KDM1A表達后，發(fā)現(xiàn)其除了能夠顯著抑制HCT15細胞增殖和侵襲外，還能夠?qū)⒓毎铚贕1期；此外，AKT信號通路也明顯受到抑制。提示，KDM1A可能通過抑制AKT信號通路發(fā)揮抗結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲的作用。

圖4 各組細胞中AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達 A：Western blotting檢測結(jié)果；B：AKT信號通路相關(guān)蛋白的相對表達量Fig 4 The expression of AKT signaling pathway related proteins in each group of cells A: the result of Western blotting detection;B: the relative expression of AKT signaling pathway related proteins

AKT是PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路中的中樞效應(yīng)蛋白，活化的AKT可調(diào)控多種基因的表達，參與細胞的增殖、侵襲和凋亡等過程，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12]。p21是一種重要的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，在細胞G1/S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著負向調(diào)控的作用，同時也是一種重要的抑癌基因，參與結(jié)直腸癌的發(fā)展進程[13]；Cyclin D1是細胞周期G1/S的特異性周期蛋白，在細胞從G1期進入S期時發(fā)揮著重要的推動作用，同時也是一種原癌基因，其過度表達可導(dǎo)致結(jié)胞的增殖失控，而惡化形成結(jié)直腸癌等腫瘤[14]；MMP-2是一種能夠降解細胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶，在細胞的增殖、分化、侵襲、遷移和血管生成等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。研究[16-17]證實，AKT信號通路可調(diào)控p21、Cyclin D1和MMP-2的表達，參與細胞的增殖和侵襲過程。為了進一步探討下調(diào)KDM1A表達抑制結(jié)直腸癌的增殖侵襲的分子機制，本研究采用Western blotting進一步檢測HCT15細胞中AKT信號通路相關(guān)蛋白p21、Cyclin D1和MMP-2的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成功轉(zhuǎn)染KDM1A干擾序列的HCT15細胞中p21蛋白表達明顯升高，而Cyclin D1和MMP-2蛋白表達明顯降低。提示，KDM1A可能通過調(diào)控AKT信號通路介導(dǎo)p21、Cyclin D1和MMP-2表達參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

總之，下調(diào)KDM1A基因可抑制結(jié)直腸癌HCT15細胞的增殖和侵襲，其分子機制可能與抑制AKT信號通路的活化有關(guān)。當(dāng)然，KDM1A除了對AKT信號通路有一定的調(diào)控作用外，還對Wnt 和Notch等信號通路有影響[18-19]，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，KDM1A在結(jié)直腸癌中的促癌作用還有待學(xué)者們更深入的研究。