鄧 峰， 繆小麗

重慶三峽中心醫(yī)院普外科，重慶 404000

胃癌在我國有著高發(fā)病率、高死亡率及低生存率的特點[1-2]，并且由于早期篩查手段的不健全，許多患者診斷出胃癌時已經(jīng)是進展期[3]，從而使其成為嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一[4]。雖然胃癌的臨床治療手段在過去幾年內(nèi)有所發(fā)展，但其術(shù)后5年生存率依然無顯著性提高[5-6]。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機制及其預后的相關(guān)分子標志物對其預防和治療有重要意義。干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM)在多種腫瘤組織中表達，其家族的3個成員IFITM1、IFITM2、IFITM3都由11號染色體對應的18 kb的基因組編碼，因此，具有高度同源性[7-8]；其中IFIT1和IFITM3在胃癌中的作用已被揭示[9-10]，但IFITM2與胃癌發(fā)展關(guān)系的研究尚少。所以，本研究主要探究IFITM2在胃癌中的作用及其與預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性研究2010年6月至2012年6月在我院行手術(shù)治療的103例胃癌患者，男68例，女35例，年齡(55.66±8.50)歲(29～72歲)，其中<60歲的患者有73例，≥60歲的患者有30例。腫瘤位于胃竇56例，胃體25例，賁門17例，胃底5例。所有患者術(shù)后組織病理學檢查均證實為胃癌。術(shù)后對所有患者隨訪5年。

依據(jù)IFITM2在胃癌中的表達量分為：750～940 pg/ml(高表達)、579～749 pg/ml(中表達)、230～578 pg/ml(低表達)3個區(qū)段[8]，并研究這3個表達量區(qū)段與患者患者生存時間之間的關(guān)系。

1.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)實驗利用總RNA提取試劑盒(QIAGEN，74104)提取所有患者癌組織與癌旁組織的總RNA，并運用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN，210210)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設計IFITM2基因上游引物序列：5′-TGTGCAAACCTTCTCTCCTGT-3′；下游引物序列：5′-TGTGGATCACGGTGGACATC-3′，對照基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物序列：5′-AAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3′；下游引物序列：5′-AGATGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。分別用上述引物于熒光定量PCR儀進行擴增，擴增體系20 μl：SYBR Green Master Mix(2X) 10 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物均為1.5 μl，ddH2O 6 μl。反應條件： 95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s， 55 ℃ 15 s(循環(huán)數(shù)為35)。qPCR結(jié)果統(tǒng)計：ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt 處理組-ΔCt對照組，mRNA相對表達量=2-ΔΔCt。

1.3蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblotting)實驗按照產(chǎn)品說明書使用細胞膜和細胞核蛋白提取試劑盒(碧云天，P0033)提取總蛋白。取15 μg總蛋白上樣, 70 v電泳1.5 h。電泳結(jié)束后依據(jù)Marker切下目的條帶，并取與目的條帶凝膠大小相同的PVDF膜和濾紙，依次放好后，150 mA，轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉1 h。然后孵育一抗，用封閉液稀釋相應的IFITM2抗體(Santa Cruz；sc-373676；1∶1 000)， GAPDH抗體(碧云天，AF0006，1∶10 000)，將PVDF膜浸泡于一抗稀釋液內(nèi)，4 ℃孵育過夜。第2天孵育二抗，PBST充分洗滌PVDF膜3次，每次15 min，用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗后浸泡PVDF膜于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2 h；最后顯色曝光，每張膜滴加適量的ECL(Thermo，NCI5079)底物，孵育數(shù)分鐘后X光膠片壓片后放入顯影液及定影液中顯影及定影。

1.4酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗按照產(chǎn)品說明書使用IFITM2 ELISA試劑盒(MyBioSource，MBS9326883)，準備所有組織樣品、試劑和標準品。分別加入相應50 μl樣本至標準孔、樣品孔及空白對照孔后加入100 μl HRP，37 ℃，孵育60 min，洗板4次，加入酶標試劑A和B各50 μl，37 ℃，避光孵育15 min后加入終止液50 μl，5 min后利用450 nm波長分光光度儀器檢測吸光度值。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織與癌旁組織中IFITM2mRNA和蛋白的表達情況運用qPCR及Western blotting分別檢測IFITM2在103例患者胃癌及癌旁組織內(nèi)mRNA及蛋白的表達水平，胃癌組織IFITM2 mRNA的表達量明顯高于癌旁組織(見圖1A)，同時癌旁組織IFITM2蛋白含量明顯低于癌組織(見圖1B)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。利用ELISA檢測103例胃癌患者胃癌組織與癌旁組織內(nèi)IFITM2的表達量，癌旁組織及癌組織IFITM2表達量平均值分別為(301.94±83.30)ng/L、(654.42±149.10)ng/L(見圖1C)，癌組織內(nèi)IFITM2表達量明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：N:胃癌組織;T:癌旁組織。*P<0.05。

2.2胃癌組織IFITM2表達量與患者性別、年齡、癌腫大小、TNM分期及分化程度的關(guān)系ELISA檢測結(jié)果顯示，IFITM2表達量與患者性別、年齡無顯著相關(guān)性(P>0.05)。但與癌腫大小、TNM分期呈顯著正相關(guān)，與分化程度呈顯著負相關(guān)(P<0.01)。胃癌腫塊越大，TNM分期越高，IFITM2表達量越高；但胃癌的分化程度越高，其表達量越低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 IFITM2表達量與患者性別、年齡、癌腫大小、TNM分期及分化程度的關(guān)系Tab 1 The relationship of IFITM2 expression with sex, age,size of tumor, TNM stage and degree of differentiation

2.3IFITM2表達量與患者生存時間之間的關(guān)系利用Kaplan-Meier法分析103例患者5年隨訪結(jié)果得出：IFITM2低表達患者5年生存率為42.9%，生存時間為(52.34±2.16)個月，IFITM2中表達患者5年生存率32.4%，生存時間為(44.82±2.89)個月，IFITM2高表達患者5年生存率17.6%，生存時間為(30.59±3.47)個月。IFITM2與患者的術(shù)后5年生存率呈顯著負相關(guān)(P<0.05)(見圖2)。

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，每年全世界大約有99萬患者被診斷為胃癌，其中約73萬因此而死亡，從而使其成為第四常見的腫瘤及第二因其而死亡的惡性腫瘤[11]。胃癌發(fā)病率在不同的國家有所不同，但我國的發(fā)病率卻相對較高，男女發(fā)病率約為2∶1。

圖2 IFITM2表達量與患者生存時間之間的關(guān)系 Fig 2 Relationship between IFITM2 expression and survival time of patients

胃癌是一個多因素引起的疾病，其中環(huán)境和遺傳因素都起著重要的作用[12-13]。早期胃癌多數(shù)患者無明顯癥狀，少數(shù)人有嘔吐、惡心或類似潰瘍病的上消化道癥狀，難以引起足夠的重視[14]。隨著腫瘤的生長，影響胃功能時才出現(xiàn)較為明顯的癥狀，但均缺乏特異性，再加上目前有限的治療手段和較差的臨床預后使得尋找一個可預見生存時間的預后因子及治療手段迫切重要[15-16]。IFITM在腫瘤中的作用近年來越來越受到關(guān)注，因此，本研究以IFITM2基因為切入點，深入探究其與胃癌發(fā)生及預后的關(guān)系。

IFITM是很早被證實的干擾素誘導蛋白家族成員之一，又稱為1～8干擾素誘導基因家族，包括IFITM1、IFITM2和IFITM3。它們的5′端均含有干擾素刺激反應元件(ISRE)，均能被IFN-α、IFN-β和IFN-γ干擾素刺激誘導，并通過JAK-STAT信號傳導途徑，作用于ISRE后誘導IFITM蛋白的分泌[17-18]。IFITM蛋白家族不僅可以抑制多種病毒的復制，例如蟲媒病毒、冠狀病毒、絲狀病毒、崩芽病毒、甲型流行性感冒病毒和人類免疫缺陷病毒[19]；而且它們在不同的細胞生長發(fā)育過程中也起著很多重要的作用，包括免疫細胞調(diào)控、細胞黏附作用、骨礦化生殖細胞歸巢和成熟過程[20-21]。近來更有研究顯示，IFITM蛋白在腫瘤發(fā)展及遷移過程中起著重要的作用。IFITM1在食管癌、宮頸癌和卵巢癌中均高表達，IFITM1甚至可以通過促進胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲而加速其惡化[22]。IFITM3在胃癌組織內(nèi)表達量也明顯升高，其表達沉默，能有效地降低胃癌細胞株的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力[23]。在裸鼠實驗中觀測到，IFITM2在正常的星狀細胞中的表達明顯低于星狀細胞瘤[24]。同時，IFITM2與促凋亡P53基因相互作用在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的壞死通路中發(fā)揮著十分重要的作用[25]。XU等[26]研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素生長因子通過胰島素生長因子1 受體及其信號傳導及轉(zhuǎn)錄因子3通路可以部分激活I(lǐng)FITM2表達；同時，激活的IFITM2又可以調(diào)節(jié)白細胞介素6的表達及分泌。而沉默IFITM2表達可以有效地抑制腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果也顯示，在胃癌患者的癌組織內(nèi)IFITM2 mRNA和蛋白的表達量明顯高于癌旁組織。同時，胃癌腫塊越大，TNM分期越高，胃癌的分化程度越低，IFITM2表達量越高，差異均有統(tǒng)計學意義。而IFITM2高表達的胃癌患者其5年生存率卻明顯降低。

綜上所述，胃癌組織內(nèi)IFITM2的高表達可以進一步促進腫瘤的惡化，并導致胃癌患者術(shù)后5年生存率明顯下降。因此，其可以作為一個潛在的胃癌治療靶點以及對患者術(shù)后生存時間的預測因子。