吳維宇， 覃 嶺，張 軍，高 龍

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 610500

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，包括結(jié)腸癌和直腸癌。大腸癌的發(fā)病與遺傳、飲食、生活習(xí)慣及大腸相關(guān)疾病等有關(guān)，隨著人們飲食習(xí)慣及生活環(huán)境的改變，其發(fā)病率正逐年上升[1]。目前針對大腸癌的治療方法主要有手術(shù)、藥物治療、放療及化療，而化療是治療大腸癌最常用的方法之一。吲哚美辛(Indomethacin)又稱消炎痛，是一種非皮質(zhì)激素類作用較強的消炎和鎮(zhèn)痛藥[2-3]。吲哚美辛可通過抑制環(huán)氧酶的活性阻礙前列腺素的合成，抑制炎性反應(yīng)，此外，吲哚美辛還可抑制溶酶體酶的釋放及白細(xì)胞的趨化性等，達(dá)到解熱、鎮(zhèn)痛及消炎的作用[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛具有抗腫瘤的作用，可調(diào)整機體免疫反應(yīng)，同時還可起到化療增敏的作用[5-6]。奧沙利鉑(Oxaliplatin)是一種二氨環(huán)己烷的鉑類化合物，屬于第3代鉑類抗癌藥，其靶作用部位是DNA，可抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。奧沙利鉑是目前治療大腸癌常用的化療藥物之一，對5-氟尿嘧啶(5-FU)及其他鉑類化療藥物治療無效的大腸癌患者仍有效[8]。奧沙利鉑對機體神經(jīng)毒性較大，因此在臨床上使用時應(yīng)盡量減少其用量[9]。因此，本實驗以吲哚美辛與奧沙利鉑對人大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及聯(lián)合應(yīng)用起到化療增敏作用可行性進行研究，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料人大腸癌細(xì)胞株SW620(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫)；吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)品(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL底物化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Abcam公司)。

1.2人大腸癌細(xì)胞培養(yǎng)和處理人大腸癌細(xì)胞SW620培養(yǎng)于含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的大腸癌細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心5 min，以培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104ml-1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為4組，終濃度設(shè)定依據(jù)預(yù)實驗中吲哚美辛和奧沙利鉑對大腸癌細(xì)胞72 h的IC50濃度設(shè)置。吲哚美辛組加入終濃度為200 ng/ml的吲哚美辛，奧沙利鉑組加入終濃度為25 μg/ml的奧沙利鉑，吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組同時加入200 ng/ml的吲哚美辛和25 μg/ml的奧沙利鉑，對照組不加藥物處理，每組細(xì)胞均設(shè)置3個復(fù)孔，置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測各組大腸癌細(xì)胞增殖抑制情況取各組處理后24 h的細(xì)胞，采用MTT法測定各組大腸癌細(xì)胞增殖抑制情況。每孔加入MTT溶液20 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄舊培養(yǎng)液，分別加入二甲基亞砜溶液150 μl，混勻后于震蕩儀上振蕩反應(yīng)10 min，在酶標(biāo)儀上492 nm處測定吸光度值(A值)。計算各組細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=1-(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測各組大腸癌細(xì)胞凋亡情況對照組、吲哚美辛組、奧沙利鉑組、吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組處理后培養(yǎng)24 h，分別收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入約400 μl PBS溶液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μl輕輕混勻，再加入PI染液5 μl，置于室溫中避光孵育15 min，將細(xì)胞混合液加入流式上樣管中，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞情況，并統(tǒng)計各組大腸癌細(xì)胞的凋亡率。

1.5Transwell實驗檢測各組大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力在Transwell小室的上室和下室分別加入200 μl和600 μl無血清培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中孵育2 h，將待檢測的各組大腸癌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取出平衡后的Transwell小室， Transwell下室加入含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl，Transwell上室加入細(xì)胞懸液200 μl，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，用棉簽擦去上室細(xì)胞及碎片，用2 ml多聚甲醛固定10 min后加入500 μl結(jié)晶紫溶液進行染色，在倒置顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)穿膜細(xì)胞個數(shù)，統(tǒng)計細(xì)胞遷移能力。以同樣的方法檢測各組大腸癌細(xì)胞侵襲能力，Transwell上室濾膜經(jīng)Matrigel基質(zhì)膠涂覆，其余步驟同Transwell遷移實驗。以對照組為參照，計算相對遷移和侵襲指數(shù)表示細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1.6Westernblotting檢測各組大腸癌細(xì)胞中CleavedCaspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平對照組、吲哚美辛組、奧沙利鉑組、吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組處理后培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，以BCA試劑盒測定蛋白濃度，在聚丙烯酰胺凝膠電泳每個泳道孔中加入40 μg變性蛋白，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用TBS漂洗，置于質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉中封閉2 h。分別加入含Cleaved Caspase-3一抗(1∶800稀釋)、MMP-2一抗(1∶500稀釋)、MMP-9一抗(1∶500稀釋)進行雜交，4 ℃下過夜反應(yīng)，再用二抗(1∶3 000稀釋)進行雜交，室溫反應(yīng)2 h。以ECL化學(xué)發(fā)光，成像儀曝光后采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析各組大腸癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1藥物處理后對大腸癌細(xì)胞增殖的影響處理后24 h以MTT法檢測各組大腸癌細(xì)胞增殖情況，對照組、吲哚美辛組、奧沙利鉑組、吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組細(xì)胞增殖抑制率分別為0、(29.96±3.11)%、(32.14±3.45)%、(75.29±8.07)%，與對照組相比，吲哚美辛組和奧沙利鉑組單用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與單用藥組相比，吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示吲哚美辛和奧沙利鉑可抑制大腸癌細(xì)胞增殖，且吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑具有協(xié)同抑制大腸癌細(xì)胞增殖的作用。

2.2藥物處理后對大腸癌細(xì)胞凋亡的影響處理后24 h以流式細(xì)胞儀檢測各組大腸癌細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖1所示，對照組、吲哚美辛組、奧沙利鉑組、吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組細(xì)胞增殖抑制率分別為(3.46±0.42)%、(21.87±2.43)%、(22.47±2.55)%、(58.14±6.28)%，與對照組相比，吲哚美辛組和奧沙利鉑組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與單用藥組相比，吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示吲哚美辛和奧沙利鉑可誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡，且吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑具有協(xié)同誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的作用。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig 1 Apoptosis detected by flow cytometry

2.3藥物處理后對大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響處理后24 h以Transwell實驗檢測各組大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果如表1和圖2～3顯示，與對照組相比，吲哚美辛組和奧沙利鉑組的細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與吲哚美辛組及奧沙利鉑組相比，吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示吲哚美辛和奧沙利鉑可抑制大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，且吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑具有協(xié)同抑制大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)圖片 A：100×；B: 200×； 圖3 Transwell檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力(200×) A：Transwell檢測各組細(xì)胞遷移能力；B：Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲能力Fig 2 Cell culture pictures A: 100×; B: 200×; Fig 3 Transwell was used to detect cell invasion and migration ability (200×)A: cell migration ability in each group detected by Transwell; B: invasive ability of cells in each group detected by Transwell

2.4藥物處理后對大腸癌細(xì)胞CleavedCaspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響Western blotting檢測各組大腸癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4和表2所示，與對照組相比，吲哚美辛組和奧沙利鉑組的細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯升高，MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與單用藥組比， 吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著升高，MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示吲哚美辛和奧沙利鉑可上調(diào)Cleaved Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)， 吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑可協(xié)同上調(diào)Cleaved Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)。

表1 藥物對大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Tab 1 Effects of drugs on migration and invasion of colorectal

注：與對照組比較，*P<0.05；與吲哚美辛組比較，&P<0.05；與奧沙利鉑組比較，#P<0.05。

圖4 Western blotting檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平 Fig 4 The expressions of Cleaved Caspase-3, MMP-2 and MMP-9 proteins in the cells detected by Western blotting

表2 藥物對大腸癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響Tab 2 Effects of drugs on expressions of Cleaved Caspase-3, MMP-2 and MMP-9 in colorectal cancer

注：與對照組比較，*P<0.05；與吲哚美辛組比較，&P<0.05；與奧沙利鉑組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著人們生活習(xí)慣的改變，飲食、睡眠、鍛煉及工作壓力等方面的影響，大腸癌的發(fā)病率正逐年上升，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命安全[10]?；熥鳛橹委煷竽c癌的主要方法之一，化療藥物的選擇和使用是治療大腸癌的重要因素[11]。研究顯示，吲哚美辛可抑制大腸癌細(xì)胞株HCT116的增殖和侵襲[12]，此外，也有研究報道，吲哚美辛作用于宮頸癌、膽囊癌、乳腺癌、肺癌等細(xì)胞，具有較好的抗癌療效[13-15]。近期研究顯示，吲哚美辛具有化療增敏效果。奧沙利鉑是大腸癌術(shù)后輔助化療常用的化療藥物，具有較強的抗癌效果。但其神經(jīng)毒性較大，通過某些化療增敏藥物聯(lián)合奧沙利鉑治療腫瘤，可減少其毒副作用，又可增加其抗腫瘤效果[16]。因此本研究考慮將吲哚美辛與奧沙利鉑聯(lián)合作用于人大腸癌細(xì)胞，提高對大腸癌的抗腫瘤效果。實驗結(jié)果顯示，吲哚美辛和奧沙利鉑對人大腸癌細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑具有協(xié)同抑制大腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力，協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示吲哚美辛對奧沙利鉑的抗大腸癌起到增敏的效果，二者聯(lián)合使用具有協(xié)同抗癌的作用。

Caspase-3是蛋白水解酶家族成員之一，屬于凋亡執(zhí)行者[17]。Cleaved Caspase-3是Caspase-3活化形式，參與細(xì)胞凋亡的過程，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。本實驗結(jié)果顯示，吲哚美辛與奧沙利鉑組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯高于對照組，聯(lián)合使用Cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著高于單用藥組，提示吲哚美辛組、奧沙利鉑及二者聯(lián)合使用可通過誘導(dǎo)Caspase-3的活性，誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡。研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)是一種蛋白水解酶家族，可促進細(xì)胞遷移、降解細(xì)胞外基質(zhì)和裂解細(xì)胞因子等多種生理功能，與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲關(guān)系密切[19]。在多種腫瘤細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9表達(dá)水平的高低可作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力高低的指標(biāo)[20-21]。本實驗結(jié)果表明，吲哚美辛、奧沙利鉑及二者聯(lián)合使用可通過抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，抑制大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。此外已有研究證實，吲哚美辛可激活食管癌EC109細(xì)胞Caspase-3活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]；人肺癌裸鼠移植瘤實驗中，吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑可顯著抑制移植瘤中MMP-2的表達(dá)[23]。

本實驗結(jié)果顯示，吲哚美辛聯(lián)合奧沙利鉑應(yīng)用具有協(xié)同抗大腸癌的作用，其作用機制是通過上調(diào)Caspase-3的活性抑制大腸癌細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，為大腸癌的治療提供新的思路。