桑 楠，張會愛，葛 獻，陳夢雪，李學(xué)良

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江蘇 南京 210029

結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率位列世界第三。盡管內(nèi)鏡、腫瘤標志物等早期篩查手段不斷發(fā)展，但由于遺傳、環(huán)境因素等原因，患者的預(yù)后仍不盡相同[1-3]。因此，研究結(jié)直腸癌進展中的分子機制以探索新的有效的治療方法具有重要意義[4]。

補體是一組激活后具有酶活性的糖蛋白，主要存在于細胞表面及體液中，是固有免疫的基礎(chǔ)成分之一[5]，在免疫防御及維持穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。補體系統(tǒng)通過經(jīng)典途徑、凝集素途徑及旁路途徑活化，形成攻膜復(fù)合物(MAC)，溶解腫瘤細胞及細菌等[6-8]。此外，補體還能通過增強抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)來發(fā)揮殺死腫瘤細胞的功能[7, 9]。除了發(fā)揮免疫功能外，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，補體蛋白在組織再生、血管生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及細胞遷移中同樣發(fā)揮作用[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，C5a通過結(jié)合C5a受體能夠促進乳腺癌、鼻咽癌等增殖[10-11]。乳腺癌中，轉(zhuǎn)錄因子TWIST1上調(diào)C3a表達，進一步結(jié)合C3aR，促進細胞遷移及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并降低E-鈣黏蛋白的表達[12]。細胞膜表面MAC集聚能促進細胞增殖、抑制凋亡并保護細胞免受補體介導(dǎo)的細胞裂解[13]

補體C7是補體級聯(lián)反應(yīng)的終末產(chǎn)物，作為補體系統(tǒng)固有成分之一，是形成攻膜復(fù)合物的主要限速因子[14]。已有研究[5]表明，C7在肝癌干細胞中高表達，并可通過LSF-1上調(diào)干性因子 Nanog、Oct4、Sox2、C-myc等增強肝癌細胞干性。卵巢癌中C7可受PI3K-mTOR信號通路調(diào)控進一步促進卵巢癌細胞增殖[15]。有關(guān)C7在結(jié)直腸癌中的研究尚未見報道，于是本研究擬探討C7是否參與結(jié)直腸癌的進展并通過何種途徑發(fā)揮作用。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2017年5月至2017年11月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)的50例結(jié)直腸癌患者的癌組織(腫瘤細胞比例>70%)、癌旁組織(距離癌組織邊緣<2 cm)及正常組織(距離癌組織邊緣>5 cm)標本。所有組織標本在外科手術(shù)切下后立即放入液氮快速冷凍，后放入-80 ℃冰箱長期保存[16]。組織標本在放入液氮前分出部分進行甲醛固定，石蠟包埋后用于免疫組織化學(xué)染色。TNM分級是基于美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN，2015.2)。已行輔助化療或放療的患者不納入本研究。人結(jié)腸癌細胞株HCT-116、LoVo來自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科實驗室。PI3K抑制劑LY294002購自美國Cell Signaling Technology，PAKT/AKT抗體購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：細胞接種質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清(Gibco公司，美國)、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素(碧云天)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)中，置于體積分數(shù)為5%的CO2的37 ℃恒溫箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 RNA提取及實時熒光定量PCR檢測C7 mRNA水平：采用TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)提取細胞總RNA，提取的總RNA使用分光光度計進行定量及純度檢測，cDNA合成使用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，日本)，反轉(zhuǎn)錄條件是：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37 ℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)85 ℃ 5 s，4 ℃。PCR反應(yīng)體系10 μl，SYBR 5 μl，前后引物各 0.4 μl，cDNA 1 μl，DEPC水 3 μl，ROX 0.2 μl。PCR反應(yīng)條件是：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，40個循環(huán)后熔解曲線分析證實擴增的特異性，分析擴增曲線及Ct值，采用2-△△Ct法計算C7 mRNA經(jīng)內(nèi)參GAPDH標化后的相對濃度。PCR反應(yīng)在Sep One PlusTMReal Time PCR System上完成。C7和GAPDH引物由瑞博生物公司合成。C7：上游5′-GAG-ATCCTGCGTTGGAGAAAC-3′， 下游5′-TCTTTCAAGG-CAGGAGGTGAT-3′；GAPDH： 上游5′-GAAGGTGAAG-GTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.2.3 CCK-8增殖實驗：取對數(shù)生長期的HCT-116、LoVo細胞，按2×105初始密度接種在6孔板中，待細胞達到60%～70%融合時，按Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染，分組設(shè)為HCT-116空載質(zhì)粒組、HCT-116 C7過表達組、LoVo NC-siRNA組、Lovo C7-siRNA組。消化離心轉(zhuǎn)染后24 h的5組細胞，RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸后細胞計數(shù)，以2×103的細胞初始密度接種于96孔板(100 μl/孔)中繼續(xù)培養(yǎng)，使用培養(yǎng)液作為空白對照，四周空余的孔加PBS以減少培養(yǎng)液蒸發(fā)，培養(yǎng)24 h后檢測。5組各做5個復(fù)孔，每次每組隨機選擇3個孔，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)1 h后使用酶標儀檢測波長為450 nm下各孔的吸光度值。全程避光操作[17]。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色：所有組織標本均用質(zhì)量濃度為100 g/L中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，切片厚度4 μm。染色采用免疫組化S-P染色法。60 ℃烤片2 h常規(guī)脫蠟，質(zhì)量濃度為30 g/L H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉30 min，1∶400稀釋的C7兔抗人單克隆抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精染色、反藍、脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每個樣本隨機選擇5個高倍視野，并根據(jù)陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱計算免疫組化染色評分：(1)根據(jù)陽性細胞表達數(shù)評分：陽性細胞總數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)根據(jù)染色強弱評分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色 2分，棕褐色 3分。1、2項乘積即為免疫組化評分，根據(jù)評分高低比較不同組織間C7表達差異。0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中等陽性表達(++)，5分以上為強陽性(+++)[18]。結(jié)腸癌組織中C7表達量為++或+++為相對高表達組，C7表達量為-或+為相對低表達組。

1.2.5 Western blotting分析：使用中效裂解液提取細胞總蛋白，并經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，中國)測定蛋白質(zhì)濃度，12 000 r/min、4 ℃離心后取蛋白上清加入1/4體積5×SDS-蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮樣5 min。蛋白經(jīng)質(zhì)量濃度為100 g/L SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗人C7(Abcam，美國，1∶1 000)、鼠抗人GAPDH(碧云天，中國，1∶1 000)，4 ℃過夜，洗滌后加入1∶1 000辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，ECL-化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶，應(yīng)用Image J分析蛋白灰度值，以GAPDH密度值作為參照表示蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌及癌旁、正常組織中及結(jié)腸癌不同細胞株中C7的表達結(jié)直腸癌組織中C7表達量顯著高于癌旁組織(P<0.001)(見圖1A)。C7在結(jié)直腸癌組織中大量沉積，主要表達于胞漿中。相對于癌旁組織，結(jié)直腸癌組織中可見明顯的棕黃色或棕褐色顆粒(見圖1B)。C7在結(jié)腸癌細胞中HT-29、Caco-2、LoVo的蛋白水平明顯高于正常腸上皮細胞NCM460，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(見圖1C)。

圖1C7在人結(jié)直腸癌組織及結(jié)腸癌細胞系中的表達A：免疫組化評分示結(jié)直腸癌組織C7蛋白表達量明顯高于癌旁組織；B：免疫組化檢測C7蛋白在結(jié)直腸癌、癌中的表達(100×，200×)；C：Western blotting檢測C7在5種結(jié)腸癌細胞系及1種正常腸上皮細胞中的蛋白表達情況

Fig1ExpressionsofC7incolorectalcancertissuesA: immunohistochemical staining showed that the expression of C7 protein in colon cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues; B: immunohistochemistry was used to detect the expression of C7 protein in colorectal cancer, adjacent tissues and normal tissues (100×, 200×); C: Western blotting was used to detect the protein expression of C7 in 5 colon cancer cell lines and 1 normal intestinal epithelial cell line

2.2C7表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征相關(guān)性分析免疫組化評分≥3分者為C7高表達組，<3分者為C7相對低表達組。C7高表達組與C7低表達組在年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)數(shù)量、遠處轉(zhuǎn)移、術(shù)前血清CEA水平及是否吸煙等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。C7表達水平與TNM分級及腫瘤浸潤深度顯著相關(guān)(P<0.05)。T1～T2期結(jié)直腸癌患者癌組織C7水平明顯低于T3～T4期患者(P=0.016)，TNM 分級為Ⅰ～Ⅱ的結(jié)腸癌患者C7表達水平明顯低于TNM 分級為Ⅲ～Ⅳ患者(P=0.046)(見表1)。

2.3干擾和過表達C7對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響本實驗中，我們選擇對C7相對高表達細胞系LoVo進行干擾，C7相對低表達細胞系HCT-116進行過表達。圖2A為PCR檢測C7小干擾RNA及C7過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo及HCT-116轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR結(jié)果顯示，與LoVo無關(guān)序列組相比，C7小干擾RNA能明顯降低C7在LoVo細胞中的表達，而與HCT-116空載質(zhì)粒組相比，C7過表達質(zhì)粒能使HCT-116細胞中C7表達明顯升高。由于C7在卵巢癌中有促進增殖的作用，檢測C7對結(jié)腸癌細胞系增殖的影響。圖2B為干擾和過表達C7后HCT-116與LoVo細胞增殖變化。CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，過表達C7的HCT-116細胞增殖能力明顯高于對照質(zhì)粒組，干擾C7的LoVo細胞增殖能力明顯低于對照干擾組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 結(jié)直腸癌組織C7表達與臨床病理特征之間的關(guān)系Tab 1 Correlation between C7 expression and clinic pathological parameters in the colorectal cancer

圖2C7對HCT-116及LoVo增殖能力影響A：C7小干擾RNA轉(zhuǎn)染后LoVo細胞中C7的表達明顯降低，而C7過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后C7的表達明顯升高；B：CCK-8結(jié)果顯示過表達C7能明顯促進HCT-116增殖,干擾C7能明顯抑制LoVo增殖

Fig2EffectofC7onproliferationofHCT-116andLoVoA: the expression of C7 in LoVo cells was significantly decreased after transfected with C7 small interfering RNA, while the expression of C7 was significantly increased after transfected with C7 overexpression plasmid; B: CCK-8 results showed that over-expression of C7 can significantly promote the proliferation of HCT-116, interfere C7 significantly inhibited LoVo proliferation

2.4PI3K抑制劑LY294002處理對C7表達影響參考文獻[19]推薦濃度與時間，我們選擇了20 μmol/L LY294002對LoVo處理24 h。Western blotting結(jié)果顯示，20 μmol/L LY294002處理LoVo 24 h后，PI3K/AKT蛋白表達水平(0.63±0.05)明顯低于DMSO溶劑對照組(0.83±0.07)，總AKT表達無明顯變化，LY294002能明顯抑制PI3K-AKT通路。抑制劑處理組C7蛋白表達量明顯低于DMSO溶劑對照組，C7可能作為PI3K-AKT通路的下游參與對結(jié)腸癌增殖的影響(見圖3)。

圖3 PI3K抑制劑LY294002處理對C7表達的影響Fig 3 Effect of PI3K inhibitor LY294002 on C7 expression

3 討論

多種基因突變及表觀遺傳學(xué)改變可發(fā)生于結(jié)直腸癌的進展過程中，主要表現(xiàn)為癌基因的異常激活及抑癌基因的失活[20]。例如，PTEN功能失調(diào)促進Ras或PI3KCA發(fā)生突變，可與不同生長因子共同激活PI3K/AKT通路[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，C7在結(jié)直腸癌細胞中高表達。結(jié)腸癌細胞中異常激活的PI3K/AKT通路能促進C7的表達，并進一步促進結(jié)腸癌細胞的增殖。

C7是一種由C7基因編碼的121 kD大小的血清單鏈糖蛋白，與級聯(lián)反應(yīng)中C5、C6、C8、C9共同參與攻膜復(fù)合體MAC的合成[22]。C6和C5b結(jié)合后形成的C5b6復(fù)合體與C7結(jié)合后，便會產(chǎn)生亞穩(wěn)態(tài)膜結(jié)合部位，為C8和C9的結(jié)合提供錨定場所，同時C7能夠發(fā)揮趨化作用，與C8、C9共同形成MAC，溶解腫瘤細胞[23]。而近年來有研究表明，細胞膜上的攻膜復(fù)合體MAC能夠促進細胞增殖和分化，抑制細胞凋亡，并保護細胞免于補體介導(dǎo)的裂解作用[24]。這為我們進一步了解補體在腫瘤中發(fā)揮的作用提供新的思路。

C7在其他癌癥中有關(guān)表達水平的研究已有相關(guān)報道。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，C7在腫瘤相關(guān)的子宮內(nèi)膜異位癥中表達高于正常的子宮內(nèi)膜，且卵巢癌中C7的表達也明顯高于正常卵巢組織[15]。除此以外，在肝癌中，C7的表達也明顯高于癌旁組織，C7可通過增加LSF-1的表達促進肝癌細胞干性[5]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，C7在非小細胞肺癌中作為抑癌基因，其低表達與預(yù)后呈負相關(guān)，過表達C7能明顯抑制肺癌細胞的增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，C7在結(jié)直腸癌、癌旁組織中表達呈逐漸降低趨勢，且與結(jié)直腸癌患者腫瘤浸潤深度及分級相關(guān)。這提示C7可能與結(jié)直腸癌的進展相關(guān)。這也為我們進一步研究C7在結(jié)直腸癌中的功能提供研究基礎(chǔ)。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)C7具有促進卵巢癌細胞增殖的功能。研究者用PI3K通路抑制劑處理卵巢癌細胞后，C7表達量明顯下降；在卵巢癌細胞中干擾C7后卵巢癌增殖能力明顯下降，提示C7可能影響腫瘤增殖[15]。C7在結(jié)直腸癌增殖方面的研究尚無文獻報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)過表達C7能明顯促進結(jié)腸癌細胞的增殖，而對其干擾后可明顯抑制結(jié)腸癌細胞增殖，說明在結(jié)腸癌中，C7能夠作為癌基因增殖。PI3K通路抑制劑LY294002處理結(jié)腸癌細胞，C7表達量明顯減少，說明結(jié)腸癌細胞中C7可能由PI3K/AKT通路調(diào)控進一步影響結(jié)腸癌細胞增殖。以上結(jié)果均提示C7在結(jié)腸癌增殖中發(fā)揮著重要作用。

對于補體在腫瘤發(fā)展中的角色一直存在爭議。傳統(tǒng)觀念認為，補體能夠通過增強抗體(如利妥昔單抗)免疫進一步溶解細胞作用。針對腫瘤細胞的單克隆抗體通常被認為是通過補體依賴的細胞毒作用(CDC)、抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)及補體依賴的吞噬作用來進行腫瘤免疫治療[13]。然而，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，補體系統(tǒng)可通過改變腫瘤微環(huán)境及激活癌基因來促進癌癥的發(fā)生、發(fā)展。C3a、C5a可分別通過與C3aR和C5aR結(jié)合激活MAPK通路、PI3K、AKt、mTOR通路[25]，活化的C5a片段募集MDSC(髓源性抑制細胞)進入腫瘤微環(huán)境中[26]，腫瘤抑制細胞在腫瘤中局部浸潤，促進腫瘤增長并表達多種促血管生成因子[13]?；罨蜟3a也與腫瘤發(fā)生相關(guān)，黑素瘤鼠模型中觀察到C3aR-/-小鼠黑色素瘤增長速度明顯慢于對照組[27]。除此以外，還有C3、B因子等參與促進細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及生長因子的分泌，抑制細胞凋亡[28]。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)C7在結(jié)直腸癌中作為癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)展，C7的表達與結(jié)直腸癌浸潤深度及分級相關(guān)，抑制PI3K/AKT通路可通過降低C7的表達進一步抑制結(jié)直腸癌細胞增殖。然而，本研究由于樣本例數(shù)較少，并且是單中心研究，結(jié)果還有待進一步驗證。