宋曉暉 于泰隆 陳濱暉 程實 呂松岑

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI） 是指由各種原因?qū)е伦倒軆?nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)及其功能的損害，出現(xiàn)損傷水平及以下脊髓功能障礙[1]。SCI患病率在不同的地區(qū)差異較大，一項Meta分析顯示中國SCI年患病率已達(dá)37人次/100萬[2]。SCI往往導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下的感覺運動障礙，同時也可導(dǎo)致其他器官的功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，對社會以及家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)[3]。在SCI早期，特別是損傷后8 h內(nèi)，病變局限，如果藥物應(yīng)用得當(dāng)，可最大限度地避免脊髓組織結(jié)構(gòu)繼發(fā)損傷，對脊髓功能恢復(fù)具有重要意義[4]。曲克蘆丁腦蛋白水解物（troxerutin and cerebroprotein hydrolysate，TCH）注射液是一種復(fù)方合劑，多種成分協(xié)同增效，可同時作用于血管及神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)而保護(hù)損傷神經(jīng)功能并促進(jìn)其恢復(fù)[5]。TCH常用于治療腦梗死等缺血性疾病，其可以多種形式作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受進(jìn)一步損害，減輕繼發(fā)損害[6,7]。盡管已有研究探討了TCH在治療頸椎損傷高位截癱的臨床療效，表明TCH注射液可促進(jìn)脊髓神經(jīng)恢復(fù)，但其作用機(jī)制仍不明確[8]。本研究擬通過“標(biāo)準(zhǔn)脊髓損傷打擊裝置”建立SCI大鼠模型，以此評價TCH對SCI大鼠脊髓神經(jīng)功能的保護(hù)作用，探討其保護(hù)的可能機(jī)制。

材料與方法

一、實驗動物及實驗材料

成年清潔級SD大鼠180只，體質(zhì)量220～250 g，雌雄不限，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。飼養(yǎng)條件：自由進(jìn)食水，溫度為21℃～28℃，相對濕度為40%～60%。曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液（吉林四環(huán)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字 H22026572）；曲克蘆丁注射液（吉林津升制藥有限公司）；腦蛋白注射液（吉林津升制藥有限公司）。水合氯醛（成都市科龍化工試劑有限公司），防脫片劑、蘇木素復(fù)染劑與伊紅染液購自賽拓科技公司，伊文氏藍(lán)（Aladdin阿拉丁生化科技股份有限公司），甲酰胺（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院），磷酸鹽緩沖液、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）試劑盒與酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）試劑盒均購自Summus生物技術(shù)有限公司，自制SCI打擊器。

二、實驗動物分組及模型制作

1.實驗分組：將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，其中A組為假手術(shù)組，只進(jìn)行椎板切除，不進(jìn)行其他干預(yù)；其余4組SCI造模，切除椎板后制備T10 SCI模型；B組為空白對照組，術(shù)后使用1 mL生理鹽水靜脈注射；C組術(shù)后使用曲克蘆丁注射液靜脈注射0.0009 mL/g；D組術(shù)后使用靜脈注射腦蛋白水解物注射液0.0009 mL/g；E組術(shù)后靜脈注射TCH注射液0.0009 mL/g；C、D、E 組均加生理鹽水配置成 1 mL注射液。各組依照對應(yīng)藥物術(shù)后當(dāng)日開始進(jìn)行尾靜脈注射，1次/d，至各觀察終點。

2.動物造模：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100g），麻醉成功后，將大鼠俯臥位放置在可調(diào)節(jié)恒溫操作臺上，定位水平位置中央，蚊式止血鉗去除椎板進(jìn)行開窗，大小約為2 mm×3 mm。自制壓迫器（重量40 g）經(jīng)過套管垂直壓迫于脊髓之上，可見鼠尾痙攣性擺動，雙下肢痙攣收縮，約20 s后完全松弛，證明模型制備成功，繼續(xù)壓迫5 min后撤除裝置，慶大霉素鹽水溶液沖刷創(chuàng)口，逐層閉創(chuàng)。術(shù)后3 d內(nèi)，每日腹腔注射8×104U青霉素鈉預(yù)防感染。

三、行為學(xué)評價

采用 Basso Beattie&Bresnahan（BBB）評分方法評估SCI大鼠后肢功能恢復(fù)狀況，后肢全癱為0分，完全正常為21分[9]。觀察時點為術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后 3、7、14 d。

四、SCI大鼠脊髓組織學(xué)觀察

1.脊髓組織HE染色：損傷后14 d，處死大鼠并將脊髓組織取出后，福爾馬林固定，固定成功后修剪包埋。后切片制片、脫蠟、脫水，蘇木精水溶液與酒精伊紅染色液染色。

2.血液脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）滲透性檢測：采用EB染料外滲法測定，即清醒狀態(tài)下尾靜脈注射2%EB染料（2 mL/kg），染料體內(nèi)循環(huán)2 h[10]。麻醉后經(jīng)心臟使用生理鹽水灌洗，待右心耳流出液無顏色后解剖，以損傷段為中心取脊髓觀察比較。

3.脊髓含水量（水腫）評估：使用過量麻醉處死動物后，迅速移除脊髓，將脊髓切成10 mm左右組織段，測量質(zhì)量；然后迅速將組織放入100℃烘干器中，持續(xù)48 h，取出測量干質(zhì)量，根據(jù)Elliot公式測量組織含水比：含水百分比（%）=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%[11]。觀察時點為術(shù)后5、24 h及3 d。

五、脊髓組織AChE、ACP含量測定

麻醉后心臟灌注生理鹽水，沖洗干凈后取15 mm損傷段脊髓組織，按照相應(yīng)試劑盒說明書步驟操作，通過酶聯(lián)免疫分析分別測定AChE和ACP的含量。使用考馬斯亮藍(lán)測定總蛋白含量，結(jié)果表示為占總蛋白的含量（U/g）；測量的時間點分別是術(shù)前、術(shù)后當(dāng)日、術(shù)后 3、7和 14 d。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行為學(xué)測評采用重復(fù)測量方差分析，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠行為學(xué)BBB評分

術(shù)前各組BBB評分均為21分。術(shù)后，A組BBB評分與術(shù)前相同，任意觀察時間點BBB評分均顯著高于其余4組；B、C、D、E組 BBB評分術(shù)后均大幅降低，但隨時間推移又逐漸增高。術(shù)后24 h B、C、D與E組BBB評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后 7、14 d，D、E 組高于 B、C 組，C 組高于 B 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。詳細(xì)信息見表1。

二、TCH對脊髓組織的保護(hù)作用組織學(xué)觀察

1.脊髓組織HE染色：術(shù)后14 d，A組脊髓結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻；B組術(shù)后脊髓內(nèi)有大量空腔，脊髓結(jié)構(gòu)紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤，脊髓神經(jīng)細(xì)胞水腫壞死；C組有空腔形成，形態(tài)較大，其炎性細(xì)胞浸潤也較明顯，可見脊髓神經(jīng)細(xì)胞壞死。D組較A、B組炎性細(xì)胞浸潤較少，細(xì)胞水腫較輕。E組炎性細(xì)胞浸潤及水腫、壞死程度均較少，神經(jīng)細(xì)胞存活較多，未見出血。詳細(xì)信息見圖1。

表1 脊髓損傷后不同時點各組大鼠BBB運動功能評分比較（n=5，±s，分）

表1 脊髓損傷后不同時點各組大鼠BBB運動功能評分比較（n=5，±s，分）

與 A 組比較，aP＜0.05；與 B 組比較，bP＜0.05；與 C 組比較，cP＜0.05。A 組：假手術(shù)組；B組：生理鹽水組；C組：曲克蘆丁組；D組：腦蛋白水解物組；E組：曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液組。

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2.EB含量測定：注射染料后可見大鼠皮膚、肢端及眼睛迅速藍(lán)染。SCI大鼠損傷段，于5 h見輕微藍(lán)染；于24 h、3 d時見大量藍(lán)染；而A組脊髓未見明顯染色。術(shù)后5 h，B、C、D、E組EB含量顯著高于A組水平，E組EB含量顯著低于D組水平（P＜0.05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后24 h及術(shù)后3 d，B、C、D、E組EB含量均顯著高于A組；C、E組 EB含量顯著低于B、D組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。 術(shù)后 3 d，B、C、D、E 組 EB 含量均顯著高于 A組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）（圖 2A）。

圖2 血液脊髓屏障與脊髓水腫狀況觀察

3.脊髓含水量檢測：A組含水量恒定，4組模型組脊髓含水量隨時間變化逐漸增高，以術(shù)后24 h增高最顯著，且E組增高趨勢低于其余組。術(shù)后5 h，脊髓含水量各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.9536，P=0.141）。術(shù)后24 h，脊髓含水量組間差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=368.004），B、C、D、E 組脊髓含水量均顯著高于A組，C、D、E組脊髓含水量均顯著低于B組；D組脊髓含水量高于C、E組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。術(shù)后3 d，脊髓含水量組間差異顯著 （F=699.274），B、C、D、E 組脊髓含水量均顯著高于A組，C、E組脊髓含水量均顯著低于B、D組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

三、脊髓組織AChE、ACP含量

1.AChE含量測定：術(shù)前各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后模型組AChE隨時間恢復(fù)；術(shù)后當(dāng)天，AChE含量組間比較差異顯著 （F=618.432，P＜0.05），B、C、D、E 組脊髓 AChE 含量均顯著低于A組；術(shù)后3 d，AChE含量組間比較差異顯著（F=49.038，P＜0.05），B、C、D、E 組脊髓 AChE 含量均顯著低于A組，D、E組脊髓AChE含量均顯著高于B、C組；術(shù)后7 d，AChE含量組間比較差異顯著（F=80.945，P＜0.05），B、C、D、E 組脊髓 AChE 含量均顯著低于A組，D、E組脊髓AChE含量均顯著高于B、C組；術(shù)后14 d，AChE含量組間差異顯著 （F=56.754，P＜0.05），B、C、E 組脊髓 AChE 含量均與 A組比較差異顯著，D、E組脊髓AChE含量均顯著高于B、C組，E組脊髓AChE含量均顯著高于D。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 3A）。

2.ACP含量測定：術(shù)前各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.358，P＞0.05）。術(shù)后模型組 ACP隨時間逐漸升高，但A組ACP無顯著變化。術(shù)后當(dāng)天，ACP含量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.531，P=0.714）。術(shù)后 3 d，ACP 含量組間差異顯著（F=15.481，P＜0.05），B組脊髓ACP含量均顯著高于A、C、D、E組，C組脊髓ACP含量均顯著高于A、D、E組；術(shù)后7 d與14 d，ACP 含 量 組 間 差 異 顯 著 （F=14.843、F=19.468），B、C、D、E 組脊髓 ACP 含量均顯著高于 A組，D、E組脊髓ACP含量均顯著低于B、C組。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）（圖 3B）。

圖3 脊髓組織AchE與ACP表達(dá)水平

討 論

SCI是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的一種，可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，其中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致脊髓損傷的重要機(jī)制之一。TCH注射液對SCI模型大鼠有良好的治療效果，體現(xiàn)在行為學(xué)的改善、血液脊髓屏障結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定、脊髓受損細(xì)胞的保護(hù)，以及ACP生成的抑制、脊髓組織中AChE水平的恢復(fù)加速。

在SCI動物模型的運動功能評價中，BBB評分用于SCI大鼠后肢運動功能恢復(fù)過程評價，與SCI的程度高度相符[12]。本研究中，通過BBB評分發(fā)現(xiàn)TCH可促進(jìn)SCI大鼠后肢運動功能的恢復(fù)，提示TCH注射液有助于SCI大鼠的脊髓神經(jīng)功能的再生、修復(fù)和重建，有助于運動功能的恢復(fù)。在臨床實踐過程中，TCH也已被證實可加快脊髓恢復(fù)的過程[8]。關(guān)于TCH對中樞神經(jīng)功能的治療與保護(hù)，多項關(guān)于腦卒中的臨床研究有所驗證，其可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，改善腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損程度，改善患者的生存質(zhì)量[13,14]。這與本研究中TCH可促進(jìn)SCI大鼠后肢功能的恢復(fù)結(jié)果是一致的。

關(guān)于血液脊髓屏障的保護(hù)，本研究觀察了TCH對SCI大鼠脊髓BSCB及脊髓水腫狀況的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCH與曲克蘆丁均可有效地減少脊髓組織的EB含量，提示TCH注射液可以降低BSCB滲透性的改變，這可能與曲克蘆丁可降低毛細(xì)血管通透性，改善微循環(huán)有關(guān)[15,16]。在對SCI大鼠脊髓水腫狀況的觀察中發(fā)現(xiàn)，曲克蘆丁與TCH注射液干預(yù)組，術(shù)后24 h和術(shù)后3 d脊髓組織含水量均顯著低于其他干預(yù)組，術(shù)后3 d脊髓含水量達(dá)到較高水平。這與臨床中SCI發(fā)生后2～3 d內(nèi)損傷部位水腫迅速加重一致，原因可能在于脊髓水腫會加重神經(jīng)元缺血、缺氧，又進(jìn)一步加重水腫[17,18]?，F(xiàn)已證實，曲克蘆丁可改善靜脈功能、降低因各種原因而升高的毛細(xì)血管通透性，以此延緩或改善水腫的發(fā)生[15,16,19]。因此在對SCI大鼠BSCB與脊髓水腫狀況的觀察中，曲克蘆丁組與TCH組狀況均優(yōu)于生理鹽水組與腦蛋白水解物組。

膽堿能神經(jīng)介質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）的水解酶AChE，其主要生物學(xué)功能是水解ACh，保持神經(jīng)沖動的靈敏性[20]。在膽堿能神經(jīng)元中AChE的含量與ACh的合成呈平行關(guān)系，檢測AChE可間接提示ACh的含量[21]。在脊髓損傷后，兩者含量均會降低[22]。本研究發(fā)現(xiàn)SCI大鼠的脊髓AChE的含量顯著減少，并隨時間的變化恢復(fù)；而TCH組AChE的恢復(fù)速度顯著快于其他干預(yù)組，術(shù)后14 d已接近正常水平；腦蛋白水解物組，AChE的恢復(fù)速度也比較良好，但次于TCH組。結(jié)果提示曲克蘆丁可協(xié)同腦蛋白水解物促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元功能的恢復(fù)，可能的機(jī)制在于TCH作為曲克蘆丁和腦蛋白水解物組成的復(fù)合制劑，含有多肽、氨基酸等物質(zhì)，可增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接通訊的作用；曲克蘆丁可抑制血小板聚集，防止血栓形成，降低血黏度，改善微循環(huán)等作用；曲克蘆丁協(xié)同腦蛋白水解物，增強(qiáng)了脊髓神經(jīng)元的恢復(fù)能力[5,23,24]。酸性磷酸酶ACP普遍存在于多種細(xì)胞的溶酶體中，是溶酶體的標(biāo)志酶，代表著溶酶體膜滲透性的高低，其含量與活性變化可反映細(xì)胞的損傷程度。大鼠脊髓損傷后，ACP含量開始逐漸升高，表明溶酶體數(shù)量增加及功能活躍、膜滲透性增高，神經(jīng)元損傷加重[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，TCH干預(yù)的SCI大鼠ACP含量隨時間上升趨勢明顯低于其他組，提示TCH可抑制ACP含量的上升，對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。SCI過程中無論是繼發(fā)性還是原發(fā)性，均造成脊髓的缺血缺氧；缺血缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)AChE含量、活性的減弱和ACP含量、活性的增強(qiáng)，隨著缺氧狀況的改善，這兩種酶的活性和含量又呈逐漸恢復(fù)趨勢[25]。這一結(jié)果與本研究基本一致。

綜上所述，本研究證明了TCH可能通過增強(qiáng)BSCB的穩(wěn)定性，減輕SCI的水腫，保護(hù)受損脊髓神經(jīng)細(xì)胞，抑制ACP的生成、加快AChE的恢復(fù)速度，從而達(dá)到對SCI大鼠脊髓神經(jīng)功能的保護(hù)作用。然而，中樞神經(jīng)損傷研究多涉及到神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞-血管等幾部分，而本研究從行為學(xué)、組織學(xué)與分子水平探討了曲克蘆丁腦蛋白水解物對脊髓神經(jīng)功能的保護(hù)，未對血管與膠質(zhì)細(xì)胞層面進(jìn)行深入的探討，其具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。本課題后期將更加深入地探討曲克蘆丁腦蛋白水解物的作用機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)的臨床研究。