朱健偉 李益飛 王兆濤 賈偉強 陳晨 汪繼 顧應(yīng)江 徐如祥

哺乳動物的小腦在運動平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，當(dāng)機體出現(xiàn)小腦功能障礙時，常常表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、協(xié)同不能、測距不準(zhǔn)等運動失調(diào)?！叭髦螛印苯Y(jié)構(gòu)的小腦皮層，是小腦功能執(zhí)行的解剖基礎(chǔ)，而位居“三明治”結(jié)構(gòu)中央蒲肯野細(xì)胞層（Purkinje cell layers，PCL）的蒲肯野細(xì)胞（Purkinje cell，PC）是小腦皮層唯一的信號輸出神經(jīng)元，對于小腦功能的執(zhí)行具有不可替代的作用[1]。PC通過其伸向外側(cè)分子層的樹突，接收平行纖維和爬行纖維傳遞而來的信號，經(jīng)整合后傳遞到前庭小腦核和深部小腦核，從而完成小腦功能的執(zhí)行。

Toll樣受體-4（Toll-like receptor 4，TLR4）是 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）家族的 4 號成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達于小膠質(zhì)細(xì)胞中[2,3]。近年來TLR4逐漸被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)前體細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）和神經(jīng)元中也有表達，既參與了成年海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，同時對于神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)也具有重要的作用，其功能作用涉及到神經(jīng)損傷后的修復(fù)以及神經(jīng)退行性病變的發(fā)生發(fā)展[5-7]。而筆者最新研究證實，TLR4在小腦PC中高度表達，但其在小腦功能中的作用卻不甚明確[8]?？紤]到小腦在運動平衡功能中的重要作用，本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上進一步深入探索TLR4在小腦運動平衡功能中的作用。

材料與方法

一、實驗動物

本實驗以6月齡大小的TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠及其同窩對照的野生型（TLR4+/+）小鼠作為研究對象。TLR4-/-小鼠購自南京大學(xué)動物模式中心。經(jīng)與野生型的小鼠雜交后得到雜合子（TLR4+/-）小鼠，然后通過TLR4+/-小鼠交配繁殖得到實驗所用的TLR4-/-小鼠和其同窩對照的野生型小鼠。實驗所用小鼠均飼養(yǎng)于12 h晝夜周期的標(biāo)準(zhǔn)SPF級的實驗動物房內(nèi)，并給予充足的水和食物。

二、實驗試劑及儀器

萊卡冰凍切片機（CM1950，德國）；加速轉(zhuǎn)棒實驗儀（LE8505，Bioseb 公司，美國）；梯踏步實驗儀（Bio-FMA，Bioseb 公司，美國）。

三、方法

6月齡大小的TLR4-/-和其同窩對照的野生型小鼠被用于行為學(xué)測試，測試時間均為9:00～17:00，所有行為學(xué)實驗進行過程中，測試者均不知道受測小鼠的基因型，所有數(shù)據(jù)由另一個同樣不知道小鼠基因型的分析者進行分析。受測小鼠（野生型組10只；TLR4-/-組11只）依次進行足跡實驗、加速轉(zhuǎn)棒實驗和梯踏步實驗。

1.足跡實驗：受測小鼠的前后腳趾分別用紅色和黑色的無毒墨水涂抹后，自行通過一條墊有白紙的通道（70 cm×10 cm×10 cm）。每只受測小鼠在3次證實測試之前均經(jīng)過3次預(yù)實驗。每次所得的足跡，取6個連續(xù)的足印進行分析，每個點以腳趾中部為參考點。同側(cè)兩個后腳足印之間的距離作為步長；后腳足跡到對側(cè)下一個后腳足跡之間的垂直距離作為步寬。后腳足跡到同側(cè)前腳足跡之間的距離作為肢體間協(xié)調(diào)。每一次所得的足跡前后＜10 cm均不納入統(tǒng)計。若測試過程中小鼠突然停止或后退，則當(dāng)次測試作廢需重新測試。

2.加速轉(zhuǎn)棒實驗：受測小鼠放于加速轉(zhuǎn)棒實驗儀上，以4 r/min的初始轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動10 s之后，轉(zhuǎn)棒在4 min內(nèi)從4 r/min的轉(zhuǎn)速加速到40 r/min，并維持1 min的時間。記錄每只受測小鼠在5 min內(nèi)于轉(zhuǎn)棒儀上停留的時間以及掉下轉(zhuǎn)棒時的轉(zhuǎn)速，每只小鼠均進行3次實驗。

3.梯踏步實驗：小鼠被放于梯踏步實驗儀內(nèi)，分別用規(guī)律性的梯踏步以及不規(guī)律的梯踏步方式進行測試，規(guī)律性的梯踏步以1 cm的梯間距規(guī)律排列，而不規(guī)律的梯踏步通過1～2 cm間距不規(guī)律排列的梯增加受測小鼠的難度進行測試。每只受測小鼠在進行3次正式測試之前均進行3次預(yù)實驗。通過記錄軟件自動記錄每只受測小鼠通過所有梯的過程中腳步滑落的次數(shù)以及通過時間。

四、標(biāo)本制備

小鼠麻醉后心臟灌注磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），置換出全身血液后用4%的多聚甲醛灌注固定。完整取出小鼠腦組織并放入4%的多聚甲醛溶液中置于4℃下后固定24 h，后順次用蔗糖溶液（10%、20%、30%）進行梯度脫水。分離小腦組織，以25 μm的厚度進行冰凍切片，并收集于載玻片上。

五、H&E染色

將干燥后的冰凍切片，放入PBS溶液中清洗10 min×3次，洗去包被液，然后置于蘇木精水溶液中染色1 min后立即放入PBS溶液中清洗5 min，隨后將切片放入1%的鹽酸溶液中褪色10 s后再次用PBS清洗5 min。切片經(jīng)50%、70%、80%的乙醇溶液依次脫水5 min后放入0.5%的伊紅溶液中染色1 min。經(jīng)PBS清洗5 min后依次經(jīng)95%的乙醇和無水乙醇脫水3 min，并經(jīng)二甲苯透明后用中性樹脂封存，后置于顯微鏡下拍攝獲取圖像，以分析TLR4缺失后的小腦組織解剖結(jié)構(gòu)的變化。

六、定量分析

分別選取4對同窩對照的野生型和TLR4-/-小鼠進行小腦面積和分子層（molecular layer，ML）厚度的分析。

小腦面積的計算：每只小鼠選取6張近中線的小腦組織H&E染色切片，通過Image J軟件測量每張切片上的小腦組織面積并平均。

ML厚度測定：每只小鼠選取6張近中線的小腦組織H&E染色切片，通過Image J軟件測量每張切片上的小腦VII葉的ML厚度（定義：ML表面到PCL的垂直距離）并平均。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±sx）的形式呈現(xiàn)，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TLR4缺失減弱了小鼠的運動平衡能力

足跡實驗結(jié)果顯示 TLR4-/-小鼠在步長 （t=1.068，P=0.299）和步寬（t=-0.775，P=0.448）以及肢體間協(xié)調(diào)（t=-0.358，P=0.724）等方面與野生型小鼠比較差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，TLR4缺失并未明顯影響小鼠的步態(tài)（表1）。

加速轉(zhuǎn)棒實驗發(fā)現(xiàn)TLR4-/-小鼠在轉(zhuǎn)棒上的表現(xiàn)優(yōu)于野生型小鼠，其表現(xiàn)出比野生型小鼠更長的停留時間（t=-2.303，P=0.033）和更高的落下時的轉(zhuǎn)數(shù)（t=-2.310，P=0.032），但值得注意的是，TLR4-/-小鼠傾向于彎腰以腹部緊貼轉(zhuǎn)棒并且比野生型小鼠有著更快的步頻（表1）。

梯踏步實驗結(jié)果顯示在規(guī)律性的梯踏步實驗中TLR4-/-小鼠和野生型小鼠在腳步下滑次數(shù)上并沒有明顯的差異，但在通過時間上TLR4-/-小鼠明顯長于野生型小鼠（t=-1.507，P=0.148）。而不規(guī)律的梯踏步實驗結(jié)果顯示TLR4-/-小鼠在腳步下滑次數(shù) （t=-2.723，P=0.013）和通過時間（t=-1.661，P=0.113）上均明顯的多于野生型小鼠（表1）。

二、TLR4缺失導(dǎo)致小鼠小腦ML厚度減少

H&E染色結(jié)果顯示TLR4-/-小鼠的小腦組織在解剖學(xué)上的組織結(jié)構(gòu)和分層上與野生型小鼠并沒有明顯的差別（圖1）。進一步統(tǒng)計分析H&E染色切片上的小腦切面面積，同樣顯示2組小鼠差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.292，P=0.244）。分析ML厚度的結(jié)果顯示TLR4-/-小鼠的小腦ML厚度較野生型小鼠明顯減少（t=2.593，P=0.041），但顆粒細(xì)胞層的面積卻沒有明顯的差異（t=1.244，P=0.260）（表 2）。

討 論

前期研究證實，TLR4基因的缺失可以增加小鼠海馬區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖以及神經(jīng)元的分化，并能增強海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶[4]。前期研究數(shù)據(jù)揭示TLR4高表達于小腦PC，而小腦對于運動平衡的執(zhí)行至關(guān)重要[8]。因此本研究進一步闡述了TLR4基因在調(diào)節(jié)海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶之外還能夠參與運動平衡的調(diào)節(jié)。

表1 2組小鼠的運動平衡能力實驗結(jié)果（±sx）

表1 2組小鼠的運動平衡能力實驗結(jié)果（±sx）

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表2 2組小鼠的小腦形態(tài)學(xué)分析結(jié)果（±sx）

表2 2組小鼠的小腦形態(tài)學(xué)分析結(jié)果（±sx）

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圖1 TLR4-/-小鼠與野生型對照小鼠小腦切片H&E染色結(jié)果

TLR4-/-小鼠展示了異常的運動平衡能力。足跡實驗中步長、步寬以及肢體間協(xié)調(diào)與野生型小鼠并沒有差距，這可能歸因于TLR4-/-小鼠用更快的運動速度作為代償，彌補了運動時的步態(tài)差異[9]。同時這樣一種代償機制也使得TLR4-/-小鼠在加速轉(zhuǎn)棒實驗中的表現(xiàn)優(yōu)于野生型小鼠，這與先前Okun等[9]所觀察到的結(jié)果一致。然而，值得注意的是在加速轉(zhuǎn)棒實驗中的TLR4-/-小鼠表現(xiàn)出彎腰曲背以其腹部緊貼轉(zhuǎn)棒的姿態(tài)，這很有可能是TLR4-/-小鼠為了降低身體重心，增加步頻從而防止跌落的代償動作。TLR4曾被報道與抑郁性疾病密切相關(guān)，這與應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)的下丘腦-垂體-性腺軸的激活有關(guān)，而這條信號軸的激活也與TLR4密切相關(guān)，當(dāng)TLR4缺失的時候，小鼠在加速轉(zhuǎn)棒實驗條件下其實是處于一種應(yīng)激的狀態(tài)，因而表現(xiàn)出更快的步頻[10-13]。同樣在梯踏步實驗中觀察到，在非應(yīng)激狀態(tài)下TLR4-/-小鼠能夠通過調(diào)整其步態(tài)順利地通過規(guī)律排列的踏步梯而避免下滑，但當(dāng)踏步梯不再規(guī)律性排列的時候，TLR4-/-小鼠便展示出較野生型小鼠更差的表現(xiàn)，這也說明TLR4-/-小鼠的這種代償機制是有限的。

PC發(fā)出樹突伸向小腦ML，通過樹突棘與ML中走行的平行纖維（parallel fibers，PFs）和攀緣纖維（climbing fibers，CFs）形成突觸連接，從而接收信號的輸入[1]。本實驗觀察到TLR4-/-小鼠的ML厚度有所減少，因此推測在運動平衡功能執(zhí)行過程中其接收到的來自于PFs、CFs傳入的信息較野生型小鼠是更少的，從而導(dǎo)致小鼠的運動功能出現(xiàn)障礙。前期研究也曾報道小腦ML厚度的減少與PC的死亡有關(guān)[14,15]。

綜上所述，本研究通過運動平衡相關(guān)的行為學(xué)測試，揭示了TLR4基因的缺失可導(dǎo)致小鼠運動平衡受損。今后將進一步分析TLR4缺失對于PC的影響以及其具體的作用機制，進一步明確TLR4-/-小鼠出現(xiàn)運動平衡功能障礙的原因，也有助于揭示TLR4在PC生長、發(fā)育以及維持中的作用和機制。