夏霄璇，王博，方芳*

1(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

紅茶菌(Kombucha)是一種以糖茶水為原料，經(jīng)醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物共同發(fā)酵而成的一種有悠久歷史的民間傳統(tǒng)酸性飲料[1-2]。長期飲用紅茶菌有益于身體健康[3]，因此它是民眾喜愛的一種功能茶飲料[4]。近年來研究者在紅茶菌的發(fā)酵工藝、營養(yǎng)成分與保健功效、功能微生物等方面已展開了多項研究[5-8]。紅茶菌菌群中細菌的優(yōu)勢菌為醋酸菌，這使得紅茶菌發(fā)酵茶飲料酸感強烈且較為刺激，口感比較單一[9-10]。由于紅茶菌發(fā)酵體系是半開放性發(fā)酵體系[11]，發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)受微生物組成、培養(yǎng)條件與環(huán)境因素影響較大，存在不穩(wěn)定性。因此，通過添加乳酸菌強化紅茶菌發(fā)酵，對改善紅茶菌的風味與保健功效，提高產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。

乳酸菌是發(fā)酵食品和發(fā)酵飲品生產(chǎn)中重要的微生物，也是益生菌的主要來源，它們在改變食品組織結(jié)構(gòu)、強化食品風味和功能等方面發(fā)揮著重要作用[12]。已有研究證實，在泡菜發(fā)酵過程中添加乳酸菌(Lactobacilluspentosus、Leuconostocmesenteroides)能夠減少亞硝酸鹽的生成[13]，嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌發(fā)酵豆乳的甲醇提取物有抗炎作用[14]，植物乳桿菌的存在可使酸面團的品質(zhì)更佳[15]。紅茶菌在防止心血管疾病發(fā)生、促進消化功能、提高免疫、減少炎癥等方面有一定的保健功效[16]。通過在紅茶菌發(fā)酵過程中強化有益乳酸菌，不僅有助于抑制發(fā)酵體系中雜菌和致病菌的生長，還可改善紅茶菌的風味與口感，賦予紅茶菌更多益生特性。本研究擬通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，實現(xiàn)在紅茶菌發(fā)酵過程中強化乳酸菌。通過強化乳酸菌，獲得風味獨特且功效改善的紅茶菌產(chǎn)品，為其的推廣應用及提升產(chǎn)品附加值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)Y52 (CCTCC M 2012162)和棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)H3 (CCTCC M 2012130)為本研究保藏菌株，嗜酸乳酸足球菌(Pediococcusacidilactici)B1355購自中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心。紅茶菌菌種購自黑龍江美斯優(yōu)唐食品，滇紅紅茶和白砂糖購自超市。

MRS培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫80 1.0，K2HPO42.0，乙酸鈉5.0，檸檬酸三銨2.0，MgSO40.2，MnSO40.05，L-半胱氨酸0.5。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，有機酸標準溶液購自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIONSQ-456-GC氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱：DB-WAX，30 m × 0.25 mm，0.25 μm；Agilent 1260 液相儀，色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，9 μm)；BioTek多功能酶標儀。

1.3 方法

1.3.1 紅茶菌的制備

將茶葉(10 g/L)和白砂糖(70 g/L)與飲用水混合，煮沸5 min后濾去茶葉，分裝于250 mL燒杯中，蓋上4層紗布，冷卻后接種紅茶菌種子液，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d[17-18]。嗜酸乳酸足球菌B1355，短乳桿菌Y52和棒狀乳桿菌H3用MRS培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)24 h[19]，離心收集菌體，分別在紅茶菌發(fā)酵第0, 2, 4, 6天按相同菌濃添加，并根據(jù)研究需要調(diào)節(jié)紅茶菌液的初始pH值[20]。

1.3.2 有機酸含量測定

取1 mL紅茶菌液離心取上清液后用超純水稀釋10倍，再用孔徑為0.22 μm的水系濾膜過濾后待測。液相系統(tǒng)：Agilent 1260；色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，9 μm)；流動相：5 mmol/L稀硫酸；進樣體積：10 μL；洗脫速度：0.5 mL/min ；分離時間：30 min；柱溫：40 ℃；檢測器：UV210 nm。測定用的有機酸標準溶液購自Sigma公司的混合標準品。包含抗壞血酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸等9種常見有機酸，且濃度均為0.10 g/L。通過與有機酸標準溶液的保留時間比對來定性。定量采用外標法，將有機酸混合標準品在同樣的色譜條件下進樣，繪制各種有機酸的濃度對峰面積的標準曲線[21]。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測定

(1)

1.3.4 感官評定

感官評定采用雙盲評定方法，從色澤、氣味、滋味3個方面對紅茶菌液進行評定[24-27]。每項評定內(nèi)容滿分為10分，以總分最高，單項內(nèi)容無缺陷為最好。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)發(fā)酵條件對紅茶菌成分和功效的影響[24, 28]，本研究以產(chǎn)乳酸量、DPPH自由基清除能力為指標，選取不同的初始pH值(5、6、7、8)，乳酸菌接種量(3%、5%、7%、9%)，氮源添加量(3、4、5、6、7 g/L)，有機氮源(蛋白胨)與無機氮源(硫酸銨)添加比例(2∶1，1∶1，1∶2)4個因素進行單因素試驗。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇初始pH值，氮源添加量，有機氮源與無機氮源添加比例，乳酸菌接種量作為考察因素，以產(chǎn)乳酸量、自由基清除能力以及感官評分為指標，設(shè)計L9(34)的正交試驗以確定最優(yōu)發(fā)酵條件，因素和水平如表1所示。根據(jù)正交試驗結(jié)果，確定乳酸菌復配紅茶菌發(fā)酵的最優(yōu)條件，并進行實驗驗證。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal design

注：A-培養(yǎng)體系初始pH值；B-短乳桿菌接種量(%)；C-氮源添加量(g/L)；D-有機與無機氮源添加質(zhì)量比

1.3.6 揮發(fā)性物質(zhì)含量檢測

采用GC-MS法測定揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量的方法[24]。揮發(fā)性物質(zhì)的定性與定量分析利用譜庫和文獻描述對得到的質(zhì)譜圖進行串聯(lián)檢索，確定化合物的組成，通過面積歸一化法計算各組分的相對峰面積并換算為百分比進行相對定量。

將5.0 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，將老化后的75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min。

GC條件：采用WB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為He，流速0.8 mL/min。色譜柱升溫程序為：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升到90 ℃，隨后以10 ℃/min升到230 ℃，保持7 min。進樣口溫度250 ℃，無分流進樣。

MS條件：電離方式為EI源，電子能量70 eV，發(fā)射電流80 μA；離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃；檢測電壓1.0 kV，掃描模式為全掃描，質(zhì)量范圍20～450 u。

2 結(jié)果與討論

2.1 用于紅茶菌復配的乳酸菌菌株的確定

乳酸菌可以發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸等多種有機酸，并且具有促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、增加人體有益菌群、抗氧化等多種益生功能[29-31]。由于紅茶菌液的pH值在發(fā)酵第1～2天迅速下降[32]，體系中氮源匱乏，不利于乳酸菌的生長和代謝。因此選擇最優(yōu)的乳酸菌菌株以及適宜的培養(yǎng)條件尤為重要。本研究首先調(diào)節(jié)紅茶菌液初始pH值至7.0，發(fā)酵起始接種體積分數(shù)為7%的乳酸菌，在補充少量氮源的條件下，考查添加不同乳酸菌對紅茶菌中有機酸種類、含量以及其對自由基清除能力的影響。由圖1可知，能使紅茶菌液中乙酸含量減少且其他有機酸含量增加效果最好的乳酸菌是短乳桿菌Y52。強化短乳桿菌Y52后，紅茶菌液中乳酸含量增加至1.82 g/L，酒石酸和檸檬酸含量顯著增加，乙酸含量顯著減少，由11.63 g/L降至8.63 g/L，減少了25.8%。強化棒狀乳桿菌H3的紅茶菌液中乳酸含量增加至1.12 g/L，酒石酸含量增加了70%，乙酸含量略有增加。強化乳酸足球菌B1355的紅茶菌液中乳酸含量增加至1.10 g/L，有少量蘋果酸生成，酒石酸和乙酸含量有所減少。

自由基對細胞成分進行有害進攻會造成細胞衰老，而維持體內(nèi)適當水平的自由基清除能力可以延長壽命和延緩衰老[33]。通過在紅茶菌發(fā)酵過程中強化短乳桿菌Y52，紅茶菌液的自由基清除能力由42.6%上升至63.7%，相對提高了49.5%；強化棒狀乳桿菌H3的紅茶菌液自由基清除能力提高了15.5%；強化乳酸足球菌B1355的紅茶菌自由基清除能力基本沒有變化。

圖1 強化乳酸菌對紅茶菌液中有機酸合成的影響Fig.1 Effect of enhancing lactic acid bacteria during Kombucha fermentation on organic acids production

由于添加乳酸足球菌B1355對紅茶菌有機酸組成和自由基清除能力方面的改善均不突出，因此僅對強化短乳桿菌Y52或棒狀乳桿菌H3的紅茶菌進行了感官評定。由表2可知，強化短乳桿菌Y52的紅茶菌在色澤和口感等方面均明顯優(yōu)于對照，而強化棒狀乳桿菌H3對紅茶菌的口感并無改善。綜合以上結(jié)果，短乳桿菌Y52在改善紅茶菌的口感和提高紅茶菌功效方面效果顯著，適合用于復配紅茶菌并進行后續(xù)發(fā)酵工藝優(yōu)化。

表2 紅茶菌的感官評定Table 2 Sensory evaluation of Komucha

通過對強化短乳桿菌Y52發(fā)酵條件的優(yōu)化，初步確定乳酸菌強化紅茶菌發(fā)酵的工藝條件：將接種紅茶菌后的紅茶液初始pH值調(diào)至7.0，發(fā)酵起始接種體積分數(shù)為7%的乳酸菌，補充少量氮源(蛋白胨2.5 g/L，硫酸銨2.5 g/L) (表3)。

表3 培養(yǎng)條件對添加短乳桿菌Y52發(fā)酵紅茶菌的影響Table 3 Effect of cultivation conditions on Kombucha fermentation with the addition of L. brevis Y52

2.2 強化乳酸菌的紅茶菌發(fā)酵條件單因素實驗

根據(jù)發(fā)酵條件對紅茶菌成分和功效的影響，以產(chǎn)乳酸量、DPPH自由基清除能力為指標，選取初始pH值、乳酸菌接種量、氮源添加量、有機氮源與無機氮源添加比例這4個因素進行單因素試驗。由圖2-A可以看出，初始pH值對強化短乳桿菌Y52發(fā)酵的紅茶菌自由基清除能力影響不明顯，但是對乳酸水平有顯著影響。初始pH值為5～7時紅茶菌中乳酸含量由0.98 g/L增至1.80 g/L。綜合考慮初始pH值對乳酸菌復配紅茶菌自由基清除能力以及乳酸含量的影響，將初始pH值為6、7、8作為后續(xù)考察的3個水平。短乳桿菌Y52的接種量對紅茶菌自由基清除能力幾乎沒有影響，但對乳酸含量影響顯著。當Y52接種量為3%和5%時，紅茶菌中不含乳酸；當接種量大于5%時，乳酸含量隨接種量的增加而增加(圖2-B)。因此，確定要考察的Y52接種量為7%、8%、9%。當向紅茶菌中補充3 g/L氮源時，紅茶菌的自由基清除能力最低，為47.5%；當?shù)春看笥? g/L時，紅茶菌的自由基清除能力有所提高，其中添加4 g/L氮源時，強化短乳桿菌Y52發(fā)酵紅茶菌的自由基清除能力最高60%。此外，紅茶菌中氮源含量增加也會使發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中乳酸增加(圖2-C)。綜合考慮，取氮源含量4、5、6 g/L作為后續(xù)考察的3個水平。當有機、無機氮源添加比例不同時，對乳酸菌復配紅茶菌的自由基清除能力幾乎沒有影響。但隨著有機氮源補充比例的降低，紅茶菌中乳酸含量逐漸降低(圖2-D)。如果有機氮源比例較高，不僅對紅茶液的滋味和氣味有不良影響，而且還會增加生產(chǎn)成本。綜合考慮，取有機氮源與無機氮源比例為2∶1，1∶1，1∶2作為后續(xù)考察的3個水平。

圖2 工藝條件對紅茶菌發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of fermentation conditions on Kombucha fermentation

2.3 強化乳酸菌的紅茶菌發(fā)酵條件優(yōu)化

為了獲得最優(yōu)的強化乳酸菌發(fā)酵紅茶菌的條件，在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過正交實驗設(shè)計，分別考察了(A)初始pH值，(B)乳酸菌接種量，(C)氮源補充量，(D)有機、無機氮源補充比例4個因素對強化乳酸菌進行紅茶菌發(fā)酵的影響。由表4可知，4個因素對復配紅茶菌感官品質(zhì)的影響程度由大到小依次為D>A=B>C，即有機、無機氮源補充比例>初始pH值=乳酸菌接種量>氮源補充量，最優(yōu)水平為A2B1C1(C3)D3；4個因素對復配紅茶菌乳酸含量的影響程度由大到小依次為C>B>D>A，即氮源補充量>乳酸菌接種量>有機、無機氮源補充比例>初始pH，最優(yōu)水平為A3B2C2D2；4個因素對復配紅茶菌的DPPH自由基清除能力的影響程度由大到小依次為A>B>C>D，即初始pH值>乳酸菌接種量>氮源補充量>有機、無機氮源補充比例，最優(yōu)水平為A3B2C3D1。

表4 正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析Table 4 Design of orthogonal test for Kombucha fermentation and corresponding results

注：A-紅茶菌初始pH值；B-短乳桿菌Y52接種量；C-氮源；D-有機與無機氮源質(zhì)量比。

本研究希望獲得感官評價較好，乳酸含量較高以及DPPH自由基清除能力強的紅茶菌發(fā)酵工藝條件。所以在選擇最優(yōu)發(fā)酵條件時，首要考慮滿足感官指標。有機與無機氮源添加比例在感官質(zhì)量、乳酸含量、DPPH自由基清除能力3個考察指標中的重要性排序分別為1、3、4，說明有機、無機氮源添加比例的不同對感官質(zhì)量的影響更大，因此選擇D3即蛋白胨與硫酸銨的比例為1∶2為最佳條件之一。其次，初始pH值在感官質(zhì)量、乳酸含量、DPPH自由基清除能力3個考察指標中的重要性排序分別為2、4、1，則主要評價初始pH值對感官質(zhì)量以及DPPH自由基清除能力的影響。感官指標的優(yōu)水平是A2,而DPPH自由基清除能力指標的優(yōu)水平是A3，兩者結(jié)果不一致，又因為A3在感官指標中排末位，而A2在DPPH自由基清除能力指標中排位居中，所以選擇整體表現(xiàn)較好的A2即pH=7作為最佳條件之一。由于乳酸菌的接種量在感官質(zhì)量、乳酸含量、DPPH自由基清除能力3個考察指標中的重要性排序分別為3、1、3，表明乳酸菌接種量的多少對乳酸生成量的影響最大，且乳酸含量與DPPH自由基清除能力的優(yōu)水平均為B2，因此選擇B2即乳酸菌接種量為8%作為最佳條件之一。氮源含量對3個考察指標的優(yōu)水平的影響差異略大，在感官質(zhì)量、乳酸含量、DPPH自由基清除能力3個考察指標中的重要性排序分別為4、1、3，優(yōu)水平分別為C1(C3)、C3、C2。其中C3在DPPH自由基清除能力指標中排位居中，而C1與C2在其他指標中均有排在末位的情況，不符合篩選原則，因此選擇C3，即氮源添加量為6 g/L作為最佳條件之一。因此，通過正交實驗設(shè)計確定的乳酸菌復配紅茶菌的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B2C3D3，即初始pH值為7，接種體積分數(shù)為8%的乳酸菌，氮源添加6 g/L,有機氮源與無機氮源質(zhì)量比為1∶2。

2.4 最優(yōu)發(fā)酵條件驗證

通過優(yōu)化添加短乳桿菌Y52的紅茶菌發(fā)酵工藝，紅茶菌液中蘋果酸和乳酸占總酸含量有所增加，其中乳酸含量增加到3.08 g/L；抗壞血酸、酒石酸、琥珀酸和乙酸含量略微減少，其中乙酸含量比對照減少19.8%(圖3)。因此通過發(fā)酵優(yōu)化，紅茶菌中有機酸組成更加協(xié)調(diào)，有助于風味的改善。工藝優(yōu)化后茶菌液的自由基清除能力與優(yōu)化前相同，比對照提高37.8%。強化短乳桿菌Y52發(fā)酵紅茶菌制得的紅茶菌液顏色變淺且更為透亮。

對照A-不添加乳桿菌；實驗1-添加短乳桿菌Y52;實驗2-添加短乳桿菌Y5并優(yōu)化發(fā)酵工藝圖3 紅茶菌中有機酸種類與含量的分析和比較Fig.3 Quantification of organic acids in Kombucha

采用優(yōu)化條件制備的紅茶菌酸味柔和、口感協(xié)調(diào)，評價最優(yōu)(表5)。

為進一步分析強化短乳桿菌改善紅茶菌風味的原因，采用SPME-GC-MS對紅茶菌中的揮發(fā)性物質(zhì)進行了分析和比較。由表6可知，紅茶菌中既含有芳樟醇這類具有高銳顯著花香的茶葉特征香氣物質(zhì)[34]，也有像壬醛、辛酸這樣具有果香味的物質(zhì)[35]，構(gòu)成了紅茶菌特有的風味物質(zhì)。與不添加乳酸菌的紅茶菌相比，強化短乳桿菌Y52的紅茶菌中風味物質(zhì)的總量和種類均有提高：風味物質(zhì)相對含量總量從63.78%增加到65.19%，種類增加了7種(表6)。

表5 紅茶菌的感官評定Table 5 Sensory evaluation of Kombucha

表6 紅茶菌中風味物質(zhì)的相對含量Table 6 The relative content of volatile compounds in Kombucha

強化短乳桿菌Y52的紅茶菌中新增風味物質(zhì)種類17種，包括醇類5種、醛類1種、酯類2種、酸類2種、酮類3種、酚類2種、其他2種。新增酮類物質(zhì)中3-羥基-2-丁酮、2-甲基四氫噻吩-3-酮是賦予食品奶油香和栗子香味的風味物質(zhì)，甲基庚烯酮是具有青草柑橘味的物質(zhì)[35]。強化乳酸菌紅茶菌桃醛(γ-十一內(nèi)酯)、橙花醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚等香味物質(zhì)新增或含量成倍增加。由于強化短乳桿菌的紅茶菌中醇類、酯類、醛類化合物種類較對照組更為豐富，可使醇類與酯類、醛類相互作用，融合出的味道協(xié)調(diào)細膩，給人柔和、優(yōu)雅、愉悅的感覺[36]。此外，強化乳酸菌的紅茶菌中功能性有益的物質(zhì)如短鏈脂肪酸、抗氧化的黃酮類物質(zhì)(檸檬烯)含量也有所增加，將有助于提高紅茶菌的功能性。

3 結(jié)論

通過在紅茶菌發(fā)酵過程中強化短乳桿菌Y52，紅茶菌中有機酸組成更為合理，有效降低了不適酸感，自由基清除能力也得到了顯著提高。此外，紅茶菌在外觀、口感和風味等方面均有提高和改善。本研究通過在紅茶菌發(fā)酵過程中添加益生菌短乳桿菌Y52，顯著改善了紅茶菌的風味和口感，大幅提升了其抗氧化功效。