許帥強，孫迪，邵俊花，劉登勇*

1(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110866)

在肉制品的加工過程中常常添加一些鹽類，如食鹽，鎂鹽與鈣鹽等，通過影響肌肉蛋白質(zhì)的構(gòu)象來改變肌肉蛋白質(zhì)的功能特性，最終改善肉制品的品質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化研究是理解蛋白質(zhì)功能變化不可或缺的重要環(huán)節(jié)，因為蛋白質(zhì)特定的生理活性和功能在很大程度上由其構(gòu)象決定。在肉制品加工及品質(zhì)控制基礎(chǔ)理論研究中，對肌肉蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)等變化情況進行測定，再結(jié)合肌肉蛋白質(zhì)凝膠品質(zhì)的相關(guān)變化規(guī)律，可構(gòu)建肌肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)等構(gòu)象變化和凝膠品質(zhì)間的關(guān)系，進而快速預(yù)測肌肉蛋白質(zhì)凝膠的品質(zhì)[2]。因此研究斬拌過程中不同鹽處理對肉糜凝膠蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化和水合特性的影響具有一定的指導(dǎo)意義。

作為一種快速、無損的檢測方法，低場核磁已在食品工業(yè)的多方面用于樣品水分相關(guān)性質(zhì)的檢測包括煮制對產(chǎn)品的影響，不同的冷凍、貯藏條件對于各種肉制品相關(guān)品質(zhì)的影響。此外，低場核磁還可用于快速評價豬肉的質(zhì)量等[3-4]。低場核磁可測定高水分含量樣品的水分狀態(tài)，明確水分在不同樣品中的分布情況，進而反映肉中水分-蛋白質(zhì)之間的相互作用[5]。通過運用該方法，明確水分分布與水分遷移轉(zhuǎn)變規(guī)律，可有助于理解不同鹽處理對產(chǎn)品主要品質(zhì)特性的影響[6-7]。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要是指蛋白質(zhì)分子局部區(qū)域內(nèi)，多肽鏈沿一定的方向盤繞和折疊的方式：主要是分子內(nèi)氫鍵維系的局部空間排列，包括α-螺旋和β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等[8]。傅里葉紅外吸收光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)屬于分子振動吸收光譜，可以根據(jù)蛋白質(zhì)等生物大分子對應(yīng)的紅外光譜特征吸收峰的譜型、強度、頻率等譜學(xué)參數(shù)變化，來分析不同狀態(tài)、不同濃度及不同環(huán)境中的蛋白質(zhì)和多肽的二級結(jié)構(gòu)，而且為蛋白質(zhì)的變性過程以及蛋白質(zhì)分子間相互作用研究提供便利的手段[9-11]。同時蛋白質(zhì)和多肽在紅外光譜圖上會顯示出不同振動頻率的酰胺帶，位于1 700～1 600 cm-1的峰為酰胺I帶(amide I)，位于1 600～1 500 cm-1處的峰為酰胺Ⅱ帶(amide Ⅱ)[1]。其中，酰胺I帶對于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的研究最有價值，主要通過對羰基伸縮振動和氫鍵結(jié)構(gòu)的反映提供關(guān)于蛋白質(zhì)骨架的詳細(xì)信息，常用于研究蛋白質(zhì)的折疊，解折疊以及聚合情況[2]。另外，1 330～1 220 cm-1的酰胺Ⅲ帶也被用于歸屬蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)并探討其內(nèi)部氫鍵結(jié)合情況[12]。

該研究按照以肉糜乳化凝膠為對象，利用低場核磁共振技術(shù)對不同鹽處理肉糜乳化凝膠的H1質(zhì)子的遷移規(guī)律進行分析，進而分析蛋白質(zhì)的水合特性；對肉糜進行紅外吸收光譜測試，檢測水合階段蛋白質(zhì)空間構(gòu)象包括蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及微環(huán)境的變化規(guī)律，確定水合狀態(tài)對豬肉糜蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的影響。在肉制品加工及品質(zhì)控制的基礎(chǔ)理論研究中，跟蹤斬拌過程中氫質(zhì)子遷移變化規(guī)律，建立水合特征與分子構(gòu)象變化關(guān)系，揭示水分子在溶解和溶脹過程對蛋白分子構(gòu)象變化和分子間交聯(lián)的影響，尤其是蛋白-蛋白分子間交聯(lián)與蛋白-水分子間交聯(lián)，再結(jié)合肌肉蛋白質(zhì)凝膠品質(zhì)的相關(guān)變化規(guī)律，可明確斬拌過程中鹽類、水分與蛋白質(zhì)作用的相關(guān)性，為健康的乳化性肉制品開發(fā)和品質(zhì)控制奠定基礎(chǔ)，促進肉類加工的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌，購于當(dāng)?shù)卮鬂櫚l(fā)超市；食鹽(NaCl)、復(fù)合磷酸鹽(三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉，質(zhì)量比1∶1∶1)，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TJ12-H絞肉機，廣東恒聯(lián)食品機械制有限公司；Stephan-M5低溫真空斬拌機，德國Stephan機械有限公司；SY-1230恒溫水浴槽，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；BCD-215KALM海爾立式冷藏柜，青島海爾股份有限公司；低場核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；Allegra 64R低溫高速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凝膠樣品制備

制備程序參照YOUSSEF的方法[13]，稍加改動。對經(jīng)過前處理的豬背最長肌，首先用孔徑為6 mm的絞肉機絞碎得到碎肉；再將絞碎的豬背最長肌(1 000 g)與食鹽(50 g)、磷酸鹽(6.25 g)一起放入乳化斬拌機中高速(3 000 r/min)斬拌1 min，靜止2 min以提取鹽溶性肌原纖維蛋白；向乳化機中加入冰水(500 g)繼續(xù)斬拌2 min，獲得肉糜。

在斬拌階段按照4種方式：不加食鹽與磷酸鹽、只加食鹽、只加磷酸鹽、加食鹽+磷酸鹽，分別加入預(yù)先絞碎的豬背最長肌高速真空斬拌1 min后，停留2 min，加冰水(1∶1，500 g)后繼續(xù)真空斬拌2 min后取樣，即得到不同鹽處理方式的肉糜。

對得到的不同鹽處理方式的肉糜(空白組、食鹽組、磷酸鹽組、食鹽+磷酸鹽組)，分別從斬拌好的相應(yīng)肉餡中稱取質(zhì)量約35 g的肉糜，置于50 mL帶螺旋蓋的離心管中，低速(1 800 r/min)4 ℃離心5 min，以驅(qū)除肉糜中的氣泡，然后加蓋密封。75 ℃恒溫水浴30 min，取出離心管。靜置1 h冷卻后取樣。

1.3.2 低場核磁共振分析

使用低場核磁共振分析儀對蛋白質(zhì)的水合特性進行分析，研究蛋白質(zhì)和水分中的1H質(zhì)子相互交換和遷移的規(guī)律，用以表征蛋白質(zhì)的水合特征。方法依據(jù)BERTRAM等[14]，稍作變動。

測試樣品為：不同鹽處理的加熱肉糜。測試條件：質(zhì)子共振頻率為22 MHz，測量溫度為32 ℃。首先確定測試參數(shù)為：重復(fù)掃描32次，重復(fù)間隔時間TR為3 000 ms，采樣間隔150 μs，回波個數(shù)2 500。每個樣品平行測定5次，實驗重復(fù)3次。

樣品的測試步驟如下：取2 g肉糜，直接放入15 mm直徑的核磁管，然后插入分析儀進行分析。

自旋-自旋弛豫時間T2采用CPMG序列進行測量。CPMG得到的指數(shù)衰減曲線用儀器自帶的MultiExplnv Analysis軟件進行T2反演，得到T2值。反演結(jié)果為生成的弛豫圖和各個弛豫過程的弛豫幅值、其對應(yīng)時間常數(shù)(峰值)及其所占面積分?jǐn)?shù)、每個峰的起始時間和結(jié)束時間。為了分析方便，弛豫圖中每個組分的峰值對應(yīng)時間作為T2。每個組分峰值對應(yīng)的曲線面積，通過累積積分后作為每個組分對應(yīng)的峰面積，每個組分峰面積所占總峰面積的峰比例P2可表征對應(yīng)水分的相對含量。

1.3.3 傅里葉紅外吸收光譜測試

將制得的不同鹽處理加熱后的樣品，經(jīng)冷凍干燥72 h后研磨成粉，采用傅里葉變換紅外光譜儀測定試樣的FT-IR譜圖，KBr壓片測定。光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，信號掃描累加次數(shù)32次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對反演過的T2和P2數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，方差分析采用單因素ANOVA分析，數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的多重比較采用LSD法，不符合正態(tài)分布的用Tamhane,s-T2(M)檢驗，差異顯著性為p<0.05。

對得到的FT-IR譜圖，譜峰擬合采用Peakfit V 4.12擬合軟件。作圖采用Sigmaplot 12.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽處理肉糜加熱后的水合特性分析

本實驗中，新鮮的豬背最長肌經(jīng)歷不同鹽處理斬拌加熱后，T2弛豫時間變化不一。按照弛豫時間T2由低到高看，分別對應(yīng)與大分子緊密結(jié)合水(T2b<10 ms)，處在肌原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)粗絲與細(xì)絲之間的不易流動水(T21, 10～100 ms)以及肌原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)外的游離水(T22>100 ms)。弛豫時間越短，表明該部分水分的流動性越差，而弛豫時間越長則對應(yīng)流動性越好的那部分水分，弛豫時間越長，代表該種水分被蛋白質(zhì)束縛越不緊密[15-17]。

由圖1可以看出，與空白組相比，食鹽與食鹽+磷酸鹽處理組的T21與T22均顯著(p<0.05)增加，即該兩種相態(tài)水分的流動性顯著高于未加任何鹽處理的空白組，而該兩種相態(tài)水分在磷酸鹽單獨添加的肉糜組與空白組中差異不顯著(p>0.05)。

圖1 不同鹽處理對肉糜加熱后T2弛豫時間的影響Fig.1 Effect of different salt treatments on the heated meat batters relaxation time T2注：標(biāo)注有不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖2為不同鹽處理肉糜的弛豫組分峰面積比例的變化情況。依據(jù)弛豫組分峰面積百分比，可以估算氫質(zhì)子的相對含量，從而反映不同狀態(tài)水分群的相對含量，然后根據(jù)不同狀態(tài)水分群含量的變化情況，可以進一步評估各種狀態(tài)水分群的遷移情況[18]。

肉糜加熱后，由圖2可以看出，食鹽+磷酸鹽處理組的加熱凝膠結(jié)合水相對含量顯著低于其他處理組，不易流動水含量與食鹽組差異不顯著(p>0.05)但均顯著高于另外兩組處理結(jié)果，自由水含量則顯著低于空白處理。

圖2 不同鹽處理對肉糜加熱后弛豫峰比例P2的影響Fig.2 Effect of different salt treatments on the heated meat batters peak area proportion P2

斬拌過程中添加鹽類對于鹽溶性蛋白質(zhì)的提取至關(guān)重要，溶解性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化有很大的關(guān)系[19]，鹽溶蛋白的提取程度勢必影響蛋白質(zhì)的溶脹情況及隨后的乳化過程，最終對產(chǎn)品的品質(zhì)比如多汁性、嫩度等造成影響[1]。研究表明：鹽離子可選擇性地與暴露在蛋白表面的相反電荷結(jié)合，破壞肌球蛋白分子之間的離子鍵，使得蛋白分子與水分子的親和力增加，蛋白質(zhì)溶解[20]。另一方面，添加的鹽類使得肌原纖維蛋白膨脹，增加了肌絲纖維之間的空隙，肌絲纖維對水分的截留能力減弱，促進了鹽溶性蛋白的溶解形成溶膠，因此造成弛豫時間的增加，表現(xiàn)為水分的流動性得到增強[21]。本實驗結(jié)果也表明鹽類的加入使得主要水分流動性增強，與蛋白質(zhì)的作用幾率增大，可能使得水合作用更加充分以形成產(chǎn)品較好的質(zhì)地。

不易流動水，作為水分在肌肉中的主要(80%)存在形式，是肌肉的主要水分，這部分水分取決于肌原纖維蛋白質(zhì)凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變化，是反映肌肉系水力及其變化的主要指標(biāo)[8]。與空白對照比較，食鹽單獨使用后蛋白質(zhì)對不易流動水的束縛強度顯著(p<0.05)下降，不易流動水的流動性顯著增強；而單獨加入磷酸鹽的處理，肌肉蛋白質(zhì)對不易流動水的束縛能力顯著增強，不易流動水的流動性顯著下降。表明食鹽與磷酸鹽在蛋白質(zhì)的水合方面發(fā)揮相反的作用，食鹽添加后主要水分的流動性增加，可能水分分布相對均勻；反之，主要水分流動性下降，其活動將可能限定在一定的小范圍內(nèi)。

對于不同鹽處理的肉糜進行加熱后，只有食鹽與磷酸鹽復(fù)合添加處理的自由水含量顯著低于空白處理。在肉糜的斬拌后期加入了一定量的水，而且肉糜加熱之后，4組處理之間自由水含量的差異仍然存在，說明鹽類影響蛋白質(zhì)的水合溶脹作用，引起水分分布與流動性的差異。蛋白質(zhì)與許多化學(xué)物質(zhì)之間均存在相互作用，尤其是水、一些鹽類離子和有機溶劑常常很容易引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，甚至是變性最終影響蛋白質(zhì)的功能特性[12]。因此，有必要在進行水合特性分析的基礎(chǔ)上繼續(xù)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進行下一步的分析。

2.2 不同鹽處理加熱肉糜傅里葉紅外吸收

如圖3所示，各組加熱后的肉糜紅外光譜形狀與強度沒有明顯差異。由圖4可知，4組處理的二級結(jié)構(gòu)含量變化情況，對于β-折疊結(jié)構(gòu)，食鹽+磷酸鹽組顯著低于其他3個處理，而磷酸鹽組則顯著高于空白與食鹽組，對于α-螺旋結(jié)構(gòu)，磷酸鹽組與空白組差異不大，而食鹽+磷酸鹽組高于食鹽組高于另外2組處理。對于無規(guī)則卷曲食鹽組和磷酸鹽組相比空白組顯著降低，而β-轉(zhuǎn)角4組之間變化不大。

圖3 不同鹽處理肉糜的紅外吸收光譜Fig.3 FT-IR on the meat batters with different salt treatments

圖4 不同鹽處理肉糜加熱后的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Protein secondary structure of different salt trea- tments on the heated meat batters

維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的作用力有多種，α-螺旋與β-折疊主要是依靠氫鍵維持，且不同二級結(jié)構(gòu)的氫鍵強度不同，氫鍵在凝膠形成后維持網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中起到重要作用。水、鹽類離子、有機溶劑或溫度作用于蛋白質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化甚至是變性，都是由于它們改變了蛋白質(zhì)內(nèi)部的氫鍵作用[11]。KANG等[22]報道了提高豬肉糜中食鹽添加量，β-折疊含量有升高的趨勢。β-折疊結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)集聚和形成凝膠的基礎(chǔ)物質(zhì)，增加肉制品體系中β-折疊的含量，能夠形成良好的凝膠結(jié)構(gòu)，提高肉制品的硬度和保水性[23-24]。董昳廷等[25]也發(fā)現(xiàn)凝膠的質(zhì)構(gòu)、保水性與其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量密切相關(guān)。本實驗肉糜在由絞碎到加鹽斬拌再到加水發(fā)生水合，無規(guī)則卷曲含量呈下降趨勢。而張極震等[26]報道了類似的結(jié)果，利用FT-IR研究了水對肌紅蛋白和聚賴氨酸溴化氫結(jié)合物二級結(jié)構(gòu)的影響，認(rèn)為提高水合度，就減少了蛋白質(zhì)無序結(jié)構(gòu)含量，增加了有序二級結(jié)構(gòu)含量。

表1 外光譜酰Ⅰ帶對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的波數(shù)[1,27-28]Table 1 Deconvoluted amide I band frequencies andassignments to secondary structure for protein

2.3 相關(guān)性分析

加熱肉糜蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與水合特性的相關(guān)性分析結(jié)果如表2所示。

表2 加熱肉糜蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與水合特性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of heated meat batter proteinsecond structure and hydration states

注：*表示在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)， **表示在 0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

對于不同鹽處理加熱后的肉糜，其β-折疊含量與加熱后肉糜的不易流動水T21、自由水弛豫時間T22呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.970，p<0.05；R=-0.960，p<0.05)；α-螺旋含量與加熱后肉糜的結(jié)合水比例呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.971，p<0.05)，與不易流動水比例呈顯著正相關(guān)(R=0.980，p<0.05)。即熟肉糜中不易流動水與自由水的流動性越強，加熱后得到的肉糜中的β-折疊含量越低；熟肉糜中結(jié)合水比例越高而不易流動水比例越低，則加熱后得到的肉糜中的α-螺旋含量越低。

3 結(jié)論

在不同鹽處理的加熱肉糜中，與空白組相比較，食鹽組與食鹽+磷酸鹽組的弛豫時間T2增加，即結(jié)合水、不易流動水和自由水的流動性均增加，說明乳化凝膠對3種相態(tài)水分的束縛能力減弱，而磷酸鹽組與之相反；3個處理組(食鹽組、磷酸鹽組、食鹽+磷酸鹽組)均表現(xiàn)出P2b、P22降低而P21增加，即結(jié)合水與自由水的含量降低，部分轉(zhuǎn)化為不易流動水導(dǎo)致其含量升高。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化中，食鹽單獨加入使得部分無規(guī)則卷曲向α-螺旋轉(zhuǎn)變，而磷酸鹽的單獨添加使得部分無規(guī)則卷曲向β-折疊轉(zhuǎn)變；此外，乳化凝膠中不易流動水與自由水的流動性越強，β-折疊含量越低；乳化凝膠中結(jié)合水比例越高而不易流動水比例越低，則乳化凝膠中的α-螺旋含量越低。因此，不同鹽處理方式對肉糜凝膠的水合特性產(chǎn)生變化，進而影響肉糜凝膠的蛋白質(zhì)構(gòu)象。實際生產(chǎn)過程中，為獲得更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品，應(yīng)考慮不同方式的鹽處理。