陳丹園，沈云杰，楊燕，唐蕾,*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

血紅素是包含原卟啉及環(huán)中配位的二價鐵離子的小分子物質(zhì)[1]，廣泛存在于動植物和微生物中，主要發(fā)揮三大作用：一是血紅素中的鐵和整體鐵元素的轉(zhuǎn)換平衡直接關(guān)系到細(xì)胞甚至整個生命體能否正常運(yùn)轉(zhuǎn)[2]；二是血紅素具有間接抗氧化的功能，血紅素的降解物質(zhì)膽綠素和膽紅素是活性氧很好的捕獲劑，可以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原氛圍的穩(wěn)定[3]；三是作為血紅素蛋白的輔基，酶結(jié)合輔基后具備活性來維持生命體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[4]，這些酶在氣體運(yùn)輸儲存[5-6]、呼吸鏈的氧化還原能量代謝及電子傳遞[7-8]、調(diào)控信號通路[9-10]等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

大腸桿菌作為基因工程的常用宿主菌，主要以C5途徑合成各種卟啉物質(zhì)(圖1)，既可用于生產(chǎn)血紅素又可表達(dá)血紅素結(jié)合蛋白，但是血紅素的產(chǎn)量不足成為相關(guān)研究中的主要限制因素。國內(nèi)外學(xué)者圍繞如何提高血紅素合成前體ALA開展了大量研究工作。例如，康振等[11]將來自于Salmonellaarizona的突變基因hemAM與大腸桿菌的hemL基因共表達(dá)于E.coliDH5α，發(fā)現(xiàn)ALA產(chǎn)量大幅度提高。LEE等[12]提出hemD能加速內(nèi)源ALA的產(chǎn)生。YU等[13]經(jīng)轉(zhuǎn)錄分析提出hemA和hemL共表達(dá)后造成糖酵解途徑被抑制，ALA積累會刺激血紅素合成和呼吸代謝。

圖1 大腸桿菌血紅素合成途徑Fig.1 The heme pathway of E.coli

上述研究表明在大腸桿菌中血紅素的合成受到多種酶的調(diào)控，且大腸桿菌本身卟啉合成途徑中的關(guān)鍵基因表達(dá)對終產(chǎn)物血紅素的貢獻(xiàn)尚不清楚，為此本研究構(gòu)建了源于E.coliBL21的gltX、hemA、hemB、hemD、hemH和hemAD與pET28a的重組質(zhì)粒進(jìn)行同源表達(dá)，并考查了環(huán)境對Eco/pEA合成血紅素過程的中間產(chǎn)物ALA和終產(chǎn)物血紅素產(chǎn)量影響，為大腸桿菌本身的C5途徑酶的調(diào)控及其環(huán)境影響作出相應(yīng)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

1.1.2 酶和試劑

引物由華大基因合成；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、NotⅠ和XhoⅠ和T4 DNA連接酶均購自Takara公司；CloneEZ PCR克隆試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司；5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品、牛血紅蛋白及草酸購自Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)均購自上海生工。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5，pH 7.0，115 ℃滅菌20 min；LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂；LB Kanr培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基滅菌后溫度降至60 ℃，加入相應(yīng)比例硫酸卡那霉素溶液，終濃度為100 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株構(gòu)建

根據(jù)NCBI上公布的E.coliBL21基因組(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM946981.2)設(shè)計(jì)血紅素合成相關(guān)酶基因的引物用于基因擴(kuò)增，如表2所示。

表2 本研究中所用引物Table 2 Sequences of primers used in this study

注：表格中下劃線標(biāo)注表示酶切位點(diǎn)序列，斜體標(biāo)注表示同源臂序列，粗體標(biāo)注表示添加的RBS序列。

以pEB質(zhì)粒為例，用E.coliBL21作為模板，利用引物hemBF和hemBR擴(kuò)增得到hemB目的片段，用BamH Ⅰ和NotⅠ雙酶切pET28a和片段hemB，膠回收后以T4 DNA連接酶在適當(dāng)酶連體系中連接成新質(zhì)粒pEB如圖2-a，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中驗(yàn)證。同理，gltX、hemA、hemD和hemH基因使用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切。

最終將構(gòu)建的pEB、pEX、pED和pEH分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主E.coliBL21中，重組菌依次命名為Eco/pEB、Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pED和Eco/pEH。

表達(dá)質(zhì)粒pEAD則借助CloneEZ PCR試劑盒同源重組完成，以原pED為模板用同源臂引物hemADF和hemADR(為確保hemA和hemD均能正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在同源臂引物上引入一個pET28a的RBS序列TAAGGAGGAATCTT)擴(kuò)增得到含有RBS的hemD，隨后用Hind Ⅲ單酶切pEA使其線性化，最后將含有RBS的hemD和線性化的pEA純化后通過CloneEZ酶在22 ℃溫浴30 min后連接得到重組共表達(dá)質(zhì)粒。將上述重組共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pEAD，質(zhì)粒構(gòu)建如圖2-b。轉(zhuǎn)化后的新菌株命名為E.co/ pEAD，保存于-80 ℃甘油中。

圖2 血紅素關(guān)鍵基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Recombinant plasmids of important heme genes

1.2.2 重組蛋白表達(dá)及SDS-PAGE檢測

改進(jìn)宋艷群等[1]方法，重組菌于37 ℃，200 r/min過夜活化培養(yǎng)后以4%接種量轉(zhuǎn)接至含有Kanr的LB液體培養(yǎng)基中；待菌體的OD值為0.6～0.8時以0.5 mmol/L IPTG于37 ℃、200 r/min的條件誘導(dǎo)4 h；用0.2 mmol/L(pH=7.5)的Tris-HCl緩沖液懸浮菌體；濕菌體與緩沖液的質(zhì)量體積比為1∶16，60%的功率工作1 s、間歇3 s，超聲破碎20 min；1 000 r/min離心15 min，上清液為可溶蛋白，用一定比例的緩沖液充分懸浮沉淀后的溶液即為蛋白包涵體。

1.2.3 ALA濃度檢測

參考ZHANG[14]ALA檢測方法，以5-氨基乙酰丙酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，準(zhǔn)確配制濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L的ALA標(biāo)準(zhǔn)液；將2.0 mL新鮮ALA標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品加入到10 mL具塞離心管中，再依次添加1.0 mL乙酸鹽緩沖液(pH 4.6)和0.5 mL乙酰丙酮，在沸水浴中加熱15 min，待離心管自然冷卻至室溫，從離心管中取出2 mL反應(yīng)液，再加入2 mL DMAB顯色劑，顯色反應(yīng)30 min，以水做空白參照，在554 nm處測定吸光度(A554)。

1.2.4 血紅素卟啉濃度檢測

利用熒光法[15]檢測血紅素和卟啉濃度。取培養(yǎng)后的適量菌體[OD600× mL=8，若菌體的OD600值為0.4，則取20 mL菌液][16]于4 ℃、12 000 r/min離心5 min后得到菌體沉淀，水洗后將菌體重懸轉(zhuǎn)移至1.5 mL琥珀色離心管，離心后去上清；向1.5 mL離心管加入500 μL 20 mmol/L的草酸，于4 ℃暗室過夜靜置16 h；在各離心管中加入500 μL 2 mol/L草酸，取一半樣品(用于卟啉濃度檢測)于常溫下反應(yīng)作為實(shí)驗(yàn)對照組，另一半樣品(用于卟啉和血紅素總濃度檢測)于95 ℃水溶中加熱30 min，自然冷卻后12 000 r/min離心5 min，取200 μL于黑色96孔熒光板，進(jìn)行熒光值檢測(激發(fā)波長為400 nm，發(fā)射波長為620 nm)，兩組樣品差值即為待測血紅素濃度。

1.2.5 環(huán)境因素的設(shè)置

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置不同環(huán)境因素：溫度分別為16、25、30和37 ℃；裝液量分別為60、80、100、150和200 mL；外源添加物分別為0.2 mmol/L的FeCl2、谷氨酸(glutamate，Glu)、丙氨酸(alanine，Ala)、甘氨酸(glycine，Gly)和葡萄糖(glucose，Glc)。

2 結(jié)果與討論

2.1 血紅素酶基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建

在大腸桿菌C5途徑中(圖1)，谷氨酸由谷氨酰t-RNA合成酶(由gltX編碼)催化生成谷氨酰-tRNA，后者在谷氨酰-tRNA還原酶(由hemA編碼)催化下生成谷氨酸-1-半醛，再經(jīng)谷氨酸1-半醛-氨基轉(zhuǎn)移酶(由hemL編碼)合成ALA，后續(xù)經(jīng)ALA脫水酶、尿卟啉原Ⅲ合成酶和亞鐵螯合酶等形成卟啉至終產(chǎn)物血紅素[17]。通常，hemA參與的ALA合成是吡咯類化合物合成的限速步驟[18-19]，ALA脫水酶(由hemB編碼)是ALA合成后的第1個下游酶，尿卟啉原Ⅲ合成酶(由hemD編碼)用于催化HMB形成第1個卟啉環(huán)，亞鐵螯合酶(由hemH編碼)[20]則催化終產(chǎn)物血紅素的形成。

選取gltX、hemA、hemB、hemD、hemH作該本研究的關(guān)鍵酶基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并與pET28a載體連接成新質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

(a)3、(b)1、(c)1、(d)1、(e)1:DNA marker；(a)1:pEX雙酶切產(chǎn)物；(b)3:pEA雙酶切產(chǎn)物；(c)3:pEB雙酶切產(chǎn)物；(d)5:pED雙酶切產(chǎn)物；(e)3:pEH雙酶切產(chǎn)物圖3 重組質(zhì)粒構(gòu)建的凝膠電泳Fig.3 Construction of recombinant plasmids

各片段大小分別為1 416、1 257、975、741和963 bp，酶切結(jié)果與理論相符，測序正確，說明這些血紅素酶基因過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。將新質(zhì)粒分別命名為pEX、pEA、pEB、 pED和pEH，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21構(gòu)建成新菌株Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pEB、Eco/pED和Eco/pEH。

2.2 血紅素酶基因重組菌的表達(dá)及對卟啉合成的影響

將構(gòu)建的重組菌于0.5 mmol/L IPTG，在37 ℃條件下誘導(dǎo)4 h，5-氨基乙酰丙酸脫水酶、尿卟啉原Ⅲ合成酶、谷氨酰tRNA還原酶、谷氨酰tRNA合成酶和亞鐵螯合酶的蛋白表達(dá)如圖4所示，分析各蛋白分子量分別約為39.45、31.65、50.15、56.95和39.65 ku，大小正確。5-氨基乙酰丙酸脫水酶(由hemB編碼)和谷氨酰tRNA合成酶(由gltX編碼)誘導(dǎo)后主要以可溶蛋白存在，尿卟啉原Ⅲ合成酶(由hemD編碼)和谷氨酰tRNA還原酶(由hemA編碼)誘導(dǎo)后主要以包涵體形式存在，亞鐵螯合酶(由hemH編碼)誘導(dǎo)后則以可溶蛋白和包涵體2種形式并存。

(a)1-protein Marker；2-pEB(-IPTG)；3-pEB(+0.5mmol/L IPTG)；4-pEB包涵體；5-pET28a(-IPTG);6-pED(-IPTG)；7-pED(+0.5 mmol/L IPTG)；8-pED包涵體；9-pEA(-IPTG)；10-pEA(+0.5 mmol/L IPTG);(b)1-protein marker；2-pEH(-IPTG)；3-pEH(+0.5 mmol/L IPTG)；4-pEH包涵體；5-pET28a (-IPTG);6-pEX(-IPTG)；7-pEX(+0.5 mmol/L IPTG)；8-pEX包涵體；9-pEA包涵體；10-protein marker圖4 重組蛋白的檢測Fig.4 Detection of recombinant proteins

按1.2.4方法處理菌體后檢測血紅素卟啉，結(jié)果如圖5所示。hemA、hemB、hemD和hemH對總卟啉(包括重組菌血紅素合成途徑中產(chǎn)生的尿卟啉、糞卟啉和血紅素等)均有一定的促進(jìn)作用，其中Eco/pEA的產(chǎn)量在無IPTG誘導(dǎo)下血紅素濃度最高可達(dá)17.01 μmol/L，誘導(dǎo)條件下達(dá)14.80 μmol/L，說明hemA對血紅素合成的影響最顯著，遠(yuǎn)超過其他基因?qū)ρt素合成的影響。hemA是血紅素前體ALA合成的關(guān)鍵酶[17]，已有研究報(bào)道指出，過表達(dá)S.srizona的hemAM使ALA產(chǎn)量增加，而E.coli的hemL與S.srizona的hemAM編碼的酶協(xié)同作用可進(jìn)一步使ALA產(chǎn)量增加，過表達(dá)gltX時會出現(xiàn)ALA產(chǎn)量下降的現(xiàn)象，同時對hemB有轉(zhuǎn)錄上調(diào)作用[11]。ZHANG等[21]嘗試共表達(dá)hemAM、hemF和hemL可大幅度提升ALA產(chǎn)量，hemA、hemD和hemL共表達(dá)效果次之。

圖5 重組菌的卟啉與血紅素含量Fig.5 Contents of heme and porphyrin of recombinant strains

2.3 hemA與hemD的共表達(dá)及其對卟啉合成的影響

hemA和hemD共表達(dá)菌株Eco/pEAD按方法1.2.1構(gòu)建，其重組質(zhì)粒的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切產(chǎn)物如圖6所示，分別為5 349、2 203 bp，分子量正確，將重組質(zhì)粒pEAD送至華大測序，序列正確，菌株構(gòu)建成功。將Eco/pEAD于0.5 mmol/L IPTG 37 ℃下誘導(dǎo)5 h，檢測Eco/pEAD蛋白，如圖7所示，pEAD中hemA編碼的酶有大量包涵體形成而hemD編碼的酶并無明顯增加，該現(xiàn)象可能由于第2個基因的轉(zhuǎn)錄不完全，利用單一轉(zhuǎn)錄單元共表達(dá)時，難以控制多個目標(biāo)基因表達(dá)水平的一致性[22]。

1-DNA marker；2-pEA雙酶切產(chǎn)物；3、4-pEAD雙酶切產(chǎn)物圖6 重組質(zhì)粒構(gòu)建的凝膠電泳Fig.6 Construction of recombinant plasmids

1-pET28a；2-pEAD(-IPTG)；3-pEAD(+0.5 mmol/L IPTG)；4-pEAD包涵體；5-pEA(-IPTG)；6-pEA(+0.5 mmol/L IPTG); 7-pEA包涵體；8-pED(-IPTG)；9-pED(+0.5 mmol/L IPTG)；10-pED包涵體；11-protein marker圖7 Eco/pEAD的目標(biāo)蛋白檢測Fig.7 Target protein detection of Eco/pEAD

Eco/pEAD卟啉和血紅素含量如圖8所示，最高分別為74.90 μmol/L和22.69 μmol/L，較之高產(chǎn)菌株E.colipEA的卟啉含量76.70 μmol/L和血紅素含量26.53 μmol/L，沒有起到明顯的提升產(chǎn)量的效果，反而略有下降。LIU等[16]提出多基因強(qiáng)制表達(dá)時，各基因表達(dá)效果會減弱，2個對血紅素有利的基因常規(guī)共表達(dá)不一定會使血紅素增產(chǎn)效果疊加，與本研究結(jié)果相類似。

對各重組菌的卟啉和血紅素含量檢測分析，菌體產(chǎn)卟啉和血紅素的趨勢是基本一致的，血紅素產(chǎn)量可以作為體現(xiàn)卟啉總量積累的表征。血紅素產(chǎn)量不僅受內(nèi)源酶的調(diào)控，而且受環(huán)境因素的影響。從圖5、8結(jié)果可知，誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)酶的表達(dá)，但是不添加誘導(dǎo)劑時各酶基因?qū)ρt素產(chǎn)量提升趨勢更顯著于是在不添加誘導(dǎo)劑時對血紅素產(chǎn)量最高的Eco/pEA進(jìn)行環(huán)境因素分析，同時檢測血紅素前體物質(zhì)ALA[23]產(chǎn)量，探討在不同環(huán)境下前體物質(zhì)ALA積累與終產(chǎn)物血紅素產(chǎn)量之間的關(guān)聯(lián)。

圖8 Eco/pEAD的血紅素與卟啉含量Fig.8 Contents of heme and porphyrin of Eco/pEAD

2.4 環(huán)境因素對Eco/pEA的ALA及血紅素產(chǎn)量影響

根據(jù)2.3結(jié)果，選取不添加誘導(dǎo)劑時血紅素產(chǎn)量最高的Eco/pEA進(jìn)行環(huán)境因素分析。將Eco/pEA在各個溫度下培養(yǎng)5 h后(以O(shè)D600為0.6～0.8記為菌體培養(yǎng)的0 h)進(jìn)行ALA和血紅素的檢測，結(jié)果如圖9(a)，ALA產(chǎn)量在初期隨著溫度的升高有上升的趨勢，30 ℃時最高為27.64 mg/L，37 ℃時有所下降為23.38 mg/L。血紅素產(chǎn)量則隨溫度增加呈上升趨勢，在37 ℃時達(dá)到最高26.53 μmol/L。該結(jié)果顯示ALA積累與血紅素產(chǎn)量受溫度影響并不一致，30 ℃對產(chǎn)ALA最有利但并不是血紅素積累的最佳溫度，血紅素在37 ℃為最佳溫度。

溶氧通過搖瓶裝液量控制，Eco/pEA于37 ℃下培養(yǎng)5 h后檢測ALA與血紅素，結(jié)果如圖9(b)所示，溶氧環(huán)境的改變對ALA積累沒有太大的差異，但隨著溶氧的減少，血紅素產(chǎn)量呈上升趨勢，這可能是血紅素參與多種呼吸鏈酶的反應(yīng)，呼吸作用會對胞內(nèi)血紅素含量產(chǎn)生影響。

血紅素蛋白的重組表達(dá)中諸如Fe2+、血紅素前體ALA以及氯高鐵血紅素通常作為添加物補(bǔ)充進(jìn)培養(yǎng)基以促進(jìn)血紅素合成[24-26]。本研究選取FeCl2、Glu、Ala、Gly和Glc作為本研究的外源物添加至培養(yǎng)基中，將Eco/pEA于37 ℃下培養(yǎng)5 h檢測各產(chǎn)物。從圖9-c的結(jié)果中可知，F(xiàn)eCl2、Glu和Glc對ALA和血紅素積累都有一定的促進(jìn)作用，其中Glc的效果最明顯，使得血紅素產(chǎn)量進(jìn)一步增長到34.45 μmol/L。

Fe2+作為血紅素螯合的金屬離子，充足的Fe2+有利于血紅素的合成[27]。Glu作為大腸桿菌C5途徑合成的前體對血紅素積累作用明顯，Glc的存在會抑制ALA脫水酶導(dǎo)致ALA和血紅素的增加[28]。Ala對血紅素的增加原因尚不清楚，有待進(jìn)一步探究。FeCl2、Glu和Glc對ALA和血紅素產(chǎn)量均有促進(jìn)作用，但是Glu對ALA合成的促進(jìn)效果最明顯，而血紅素合成中Glc的促進(jìn)效果最顯著。

(a)-溫度；(b)-溶氧；(c)-外源添加物圖9 環(huán)境因素對Eco/pEA產(chǎn)ALA和血紅素產(chǎn)量的影響Fig.9 The influences of environmental factors on ALA and heme production of Eco/pEA

3 結(jié)語

大腸桿菌作為常用的基因工程宿主菌株，其卟啉類物質(zhì)的合成在菌株的生長、代謝和以血紅素為輔基酶類的異源表達(dá)中具有重要作用。本文通過對大腸桿菌卟啉合成途徑的關(guān)鍵酶基因的過表達(dá)和共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hemA基因過表達(dá)對總卟啉和血紅素的積累有明顯的促進(jìn)作用，而其他基因的過表達(dá)以及hemA和hemD的共表達(dá)則無明顯效果。通過溫度、溶氧及外源添加物對卟啉合成前體ALA及終產(chǎn)物血紅素產(chǎn)量影響的分析，發(fā)現(xiàn)適量的外源Fe2+、Glu和Glc同時提升了ALA和血紅素的含量，但溫度及溶氧對ALA和血紅素的影響并不一致。37 ℃對血紅素的積累最有利，而30 ℃時ALA含量最高；溶氧減少時血紅素含量上升，而ALA在溶氧條件改變時沒有明顯的變化規(guī)律。在37 ℃、200 mL裝液量條件下添加0.2 mmol/L Glc時，Eco/pEA的血紅素產(chǎn)量最高，可達(dá)34.45 μmol/L，是原始菌株的11.7倍，以上結(jié)果表明盡管卟啉合成途徑涉及多個關(guān)鍵酶，但它們的過表達(dá)在終產(chǎn)物血紅素合成中所起的作用明顯不同，環(huán)境因素對ALA和血紅素產(chǎn)量的影響并不總是一致，以上結(jié)果為進(jìn)一步調(diào)控大腸桿菌卟啉類物質(zhì)的合成提供了一定的理論依據(jù)。