黃文海 陳宗祐 項(xiàng)建斌 李震洋 顧曉冬

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040)

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)位于肝竇內(nèi)皮與肝細(xì)胞之間的Disse間隙內(nèi),主要參與維生素A代謝,HSCs可在多種細(xì)胞因子的作用下激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞,促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。既往研究主要關(guān)注HSCs 非免疫學(xué)功能,近年來研究發(fā)現(xiàn)活化的HSCs 還具有各種免疫細(xì)胞的特征,可表達(dá)多種免疫相關(guān)分子并分泌具有不同免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。有研究證明活化的HSCs有抑制T淋巴細(xì)胞的功能,主要通過促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)[1]。Chen等[2]利用胰島細(xì)胞移植模型來研究 HSCs在移植免疫耐受中的作用,發(fā)現(xiàn) HSCs 與胰島細(xì)胞聯(lián)合移植能夠有效地保護(hù)同種異體胰島移植物不被排斥,而胰島細(xì)胞單獨(dú)移植后很快就發(fā)生嚴(yán)重的排斥反應(yīng),這說明HSCs 能夠誘導(dǎo)同種異體胰島移植免疫耐受。Yang等[3]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),在胰島細(xì)胞移植模型中,HSCs表達(dá)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)在誘導(dǎo)移植免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用,并且發(fā)現(xiàn)γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)能促進(jìn)TRAIL基因的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)IFN-γ也能促進(jìn)HSCs中轉(zhuǎn)錄激活因子5(activating transcription factor 5,ATF5)基因的表達(dá)。ATF5是ATF/CREB(cAMP response element-binding)家族的轉(zhuǎn)錄因子,含有282個氨基酸序列,在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中扮演著多樣化的角色[4-5]。我們的研究發(fā)現(xiàn)HSCs中的ATF5可以促進(jìn)TRAIL基因的表達(dá),此HSCs與胰島細(xì)胞聯(lián)合移植,明顯延長小鼠同種異體胰島移植物的存活時間。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動物和試劑7～9周齡健康C57BL/6小鼠(H-2b)和BALB/c小鼠(H-2d),體重約25 g,雌雄不限,購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心;IFN-γ 和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自美國Sigma-Aldrich公司;胎牛血清購自美國Hyclone 公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen 公司;RT-PCR試劑盒購自美國Thermo公司;PE標(biāo)記抗小鼠TRAIL的抗體購自美國eBioscience公司;RPMI 1640干粉購自美國GIBCO公司;RPMI 1640完全培養(yǎng)液(內(nèi)含RPMI1640干粉10.4 g/L,10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、0.05 mmol/L 2-巰基乙醇、160 U/mL慶大霉素、20 mmol/L二羥乙基呱嗪乙烷磺酸、1 mmol/L丙酮酸鈉);RPMI不完全培養(yǎng)液(不加胎牛血清,其他成分與RPMI 1640完全培養(yǎng)液同)。重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rmGM-CSF)購自美國R & D公司;3H-TdR由上海市免疫學(xué)研究所提供;慢病毒(LV-ATF5-RNAi)由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供,此慢病毒是利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),針對ATF-5基因進(jìn)行RNA干擾,經(jīng)PCR和測序證實(shí),pGCL-ATF5 shRNA慢病毒載體構(gòu)建正確。

HSCs的分離和培養(yǎng)小鼠麻醉后,通過肝下下腔靜脈向肝臟內(nèi)灌注20 mL不含Ca2+和Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液(美國Mediatech公司),然后灌注1mL Ⅳ型膠原酶(1 mg/mL,美國Sigma-Aldrich公司)?？焖偾邢赂闻K、剪碎肝組織,加入Ⅳ型膠原酶(1 mg/mL),37 ℃恒溫水浴振蕩40 min。細(xì)胞懸液經(jīng)濾網(wǎng)過濾至離心管內(nèi),經(jīng)Percoll密度梯度離心法使HSCs濃聚,吸取HSCs層至離心管內(nèi),加入富含20%胎牛血清的RPMI 1640不完全培養(yǎng)液,在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7～14天。采用Desmin免疫染色法和脂滴的典型光鏡表現(xiàn)來鑒定HSCs的純度達(dá)到90%～95%。

小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的分離和培養(yǎng)無菌切取小鼠脛骨和股骨,用含有不完全RPMI 1640培養(yǎng)液的2 mL注射器反復(fù)沖洗骨髓腔,制成單細(xì)胞懸液,加紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞,377×g離心5 min去除溶解的紅細(xì)胞膜,重懸細(xì)胞,用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL;將上述所得的骨髓單細(xì)胞懸液接種至24孔板(2 mL/孔),rmGM-CSF加入培養(yǎng)體系中,濃度為10 ng/mL,倒置顯微鏡觀察后,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,輕彈培養(yǎng)板,以使粒細(xì)胞集落充分懸浮。半量換液,每孔另加含rmGM-CSF的新鮮培養(yǎng)液1 mL,終濃度保持10 ng/mL,如此隔天換液,培養(yǎng)至第6天,加入1 μg/mL LPS,繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。用吸管反復(fù)沖洗培養(yǎng)孔后收集懸浮細(xì)胞,移入離心管,377×g離心5 min,丟棄上清液,輕彈管壁重懸細(xì)胞。加入RPMI 1640不完全培養(yǎng)液,再次離心重復(fù)上述步驟后,以RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL備用。

尼龍毛柱法分離小鼠脾臟T細(xì)胞將內(nèi)徑5 mm、長約15 cm的聚乙烯塑料管一端斜形封閉后,用75%酒精消毒后晾干備用;稱取尼龍毛100 mg,高溫消毒后烘干,將尼龍毛均勻充填于塑料管內(nèi),用RPMI 1640完全培養(yǎng)液浸濕;將制備的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液重懸為2 mL,慢慢垂直加入尼龍毛柱中(注意不要留氣泡),使淋巴細(xì)胞懸液位于尼龍毛柱中央,平放柱體,置于37 ℃環(huán)境中溫育1 h;在塑料管的封閉尖端剪一小孔,保證液體通過小孔速度控制在1滴/1～2 s,用預(yù)溫的RPMI 1640完全培養(yǎng)液從上沖洗尼龍毛柱,在下段小孔處收集過柱液體,即為收集的T細(xì)胞懸液;移入離心管,377×g離心5 min,用RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)BALB/c小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞經(jīng)20Gy γ射線滅活。將滅活的BALB/c小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞和C57BL/6小鼠脾臟T細(xì)胞(2×105/孔) 于96孔圓底培養(yǎng)板中作單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction,MLR),設(shè)3個復(fù)孔,樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞按∶10比例在37 ℃、5%CO2下混合培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前18 h加入3H-TdR (0.5 μCi/孔),培養(yǎng)結(jié)束后用多頭細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上,經(jīng)1450型液體閃爍計數(shù)儀(美國Wallac公司)測定3H-TdR摻入量,結(jié)果用平均每分鐘閃爍數(shù)(count per minute,cpm)±s表示。為了檢測HSCs對T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響,我們在MLR前加入經(jīng)40 Gy γ射線滅活的HSCs(1×104/孔)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測以RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整HSCs細(xì)胞濃度至1×106/mL,取100 μL置于熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting,FACS)管,加入PE標(biāo)記抗小鼠TRAIL的抗體(美國eBioscience公司),室溫下避光溫育20 min,FACS洗滌液洗滌,FACS固定液固定,美國BD Biosciences公司流式細(xì)胞術(shù)檢測,數(shù)據(jù)分析采用FlowJo軟件進(jìn)行。PE標(biāo)記大鼠IgG2a為陰性對照。

同種異體胰島移植向C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲霉素(streptozocin,STZ)(180 mg/kg,美國Sigma-Aldrich公司)建立糖尿病小鼠模型,血糖超過350 mg/dL的C57BL/6糖尿病小鼠作為胰島移植的受體。BALB/c小鼠作為供體提供胰島。BALB/c小鼠采用異氟醚麻醉,固定于手術(shù)臺,腹部備皮消毒后,橫切口打開腹腔,在外科顯微鏡下仔細(xì)解剖胰腺,經(jīng)膽管用3 mL Ⅳ型膠原酶(1 mg/mL)灌注。切下胰腺,通過Ficoll密度梯度離心法分離胰島細(xì)胞,將300個胰島細(xì)胞吸入聚乙烯管,300×g離心5 min制成顆粒狀,用顯微外科技術(shù)將其置入受體C57BL/6糖尿病小鼠的腎包膜下。當(dāng)受體小鼠的血糖恢復(fù)并維持正常(≤150 mg/dL) 4天,則認(rèn)為移植成功。當(dāng)出現(xiàn)連續(xù)2次血糖測量均≥350 mg/dL,則認(rèn)為移植失敗,胰島被排斥。整個實(shí)驗(yàn)過程均未給予免疫抑制劑。為了研究HSCs對小鼠胰島移植的影響。我們將300個胰島細(xì)胞聯(lián)合3×105個C57BL/6小鼠的HSCs共同置入受體C57BL/6糖尿病小鼠的腎包膜下。

半定量RT-PCR使用Trizol試劑提取HSCs的總RNA,紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度。按RT-PCR試劑盒說明書以逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,以cDNA為模板加入上游引物、下游引物和Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為,RT:42 ℃ 55 min,PCR:94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)30次,延伸溫度72 ℃,10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用18S作為內(nèi)參基因,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

結(jié) 果

IFN-γ上調(diào)HSCs中ATF5mRNA水平在小鼠HSCs培養(yǎng)過程中加入IFN-γ (10 U/mL),半定量 RT-PCR分別檢測IFN-γ作用30 min、1 h、3 h、6 h、24 h后HSCs中ATF5 mRNA水平。結(jié)果顯示IFN-γ可快速上調(diào)HSCs中ATF5 mRNA水平,IFN-γ作用30 min即達(dá)到高峰(P<0.01),隨著作用時間的延長,ATF5 mRNA水平逐漸降低(圖1)。

IFN-γ上調(diào)HSCs中TRAILmRNA和蛋白質(zhì)水平半定量 RT-PCR用于檢測HSCs中TRAIL mRNA水平,如圖2所示,小鼠HSCs培養(yǎng)過程中分別加入不同濃度的IFN-γ(0.1、0.5、1、10、100 U/mL)培養(yǎng)24 h后,半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)IFN-γ可上調(diào)HSCs中TRAIL mRNA水平,隨著IFN-γ濃度的遞增,HSCs 中TRAIL mRNA水平也在逐漸增加。當(dāng)IFN-γ濃度為10 U/mL時,TRAIL mRNA水平達(dá)最高。在小鼠HSCs培養(yǎng)過程中加入IFN-γ (10 U/mL),流式細(xì)胞術(shù)檢測HSCs表面TRAIL蛋白質(zhì)達(dá)水平,結(jié)果表明IFN-γ作用24 h和48 h后,HSCs表面TRAIL蛋白質(zhì)水平明顯上調(diào)(圖3)。

The level of ATF5 mRNA.(1)P<0.01,(2)P<0.05.

圖1不同時間IFN-γ作用后HSCs中ATF5mRNA水平
Fig1ThelevelofATF5mRNAinHSCsexposed
toIFN-γatdifferenttimepoints

A:HSCs;B:HSCs+IFN-γ 0.1 U/mL,24 h;C:HSCs+IFN-γ 0.5 U/mL,24 h;D:HSCs+IFN-γ 1 U/mL,24 h;E:HSCs+IFN-γ 10 U/mL,24 h;F:HSCs+IFN-γ 100 U/mL,24 h.

圖2不同濃度IFN-γ作用后HSCs中TRAILmRNA水平
Fig2ThelevelofTRAILmRNAinHSCsexposed
toIFN-γatdifferentconcentrations

慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs后ATF-5mRNA和TRAILmRNA表達(dá)水平變化在小鼠HSCs培養(yǎng)過程中加入慢病毒(LV-ATF5-RNAi),感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為20,感染72 h后,半定量 RT-PCR檢測HSCs中ATF-5 mRNA 和TRAIL mRNA水平。如圖4所示,慢病毒感染HSCs后,HSCs中ATF5 mRNA水平明顯下降(P<0.01),TRAIL mRNA表達(dá)亦下降(P<0.05);IFN-γ作用于感染慢病毒的HSCs后,HSCs中ATF5 mRNA和TRAIL mRNA水平亦上調(diào)(P<0.01),但明顯低于未被慢病毒感染的HSCs (P<0.01)。

圖3 不同時間IFN-γ作用后HSCs表面TRAIL蛋白質(zhì)水平Fig 3 The level of TRAIL protein on HSCs exposed to IFN-γ at different time points

A:HSCs;B:HSCs+IFN-γ 10 U/mL,24 h;C:HSCs+LV-ATF5-RNAi;D:HSCs+LV-ATF5-RNAi+IFN-γ 10 U/mL,24 h.(1)P<0.01,(2)P<0.05.

圖4慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs后ATF5mRNA和TRAILmRNA水平
Fig4ThelevelofATF5mRNAandTRAILmRNAinHSCsinfectedwithLV-ATF5-RNAi

慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs對MLR的影響已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),HSCs能夠明顯地抑制T細(xì)胞的增殖[1]。我們在BALB/c小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞與C57BL/6小鼠T細(xì)胞進(jìn)行MLR時,加入C57BL/6小鼠HSCs,觀察HSCs對T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(T細(xì)胞∶樹突狀細(xì)胞∶HSCs=20∶2∶1)。發(fā)現(xiàn)HSCs可明顯抑制T細(xì)胞增殖反應(yīng)(P<0.01),而慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染的HSCs亦能抑制T細(xì)胞增殖反應(yīng)(P<0.05),但抑制作用明顯低于未被慢病毒感染的HSCs (P<0.01)(圖5)。此外,HSCs對T細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用隨著HSCs比例的增加而增強(qiáng)(圖6)。

慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs對小鼠胰島移植的影響單純胰島移植組(A組)移植胰島中位存活時間為11天;胰島聯(lián)合HSCs(B組)共同移植到小鼠的腎包膜下,移植胰島中位存活時間為88天,明顯長于A組(P<0.01);胰島聯(lián)合慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染的HSCs(C組)共同移植到小鼠的腎包膜下,移植胰島中位存活時間為18天,亦能延長胰島移植物的存活時間,與A組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染的HSCs對胰島移植物保護(hù)作用明顯不及未被慢病毒感染的HSCs,與B組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖7)。

T Cell Proliferation.(1)P<0.01,(2)P<0.05.

圖5慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs對MLR的影響
Fig5EffectofHSCsinfectedwithLV-ATF5-RNAionMLR

圖6 不同比例的HSCs對T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響Fig 6 Effect of different proportions of HSCs on T cell proliferation

Median survival time in islets grafts.(1)P<0.01.

圖7慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染HSCs
對小鼠胰島移植的影響
Fig7EffectofHSCsinfectedwithLV-ATF5-RNAi
onisletstransplantationinmurine

討 論

HSCs靜止?fàn)顟B(tài)下作為儲脂細(xì)胞主要參與維生素A的代謝,肝纖維化時HSCs 可在多種細(xì)胞因子及損傷因素的作用下激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞,產(chǎn)生大量以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì),并分泌轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor β,TGF-β)、血小板源性生長因子等各種促纖維化因子,在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),活化的HSCs具有多種免疫細(xì)胞的特性,能夠直接參與肝臟局部的免疫調(diào)控。有研究指出腫瘤微環(huán)境中的HSCs能顯著影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與浸潤[6-7]。其可能的機(jī)制一方面是活化的HSCs分泌多種細(xì)胞因子,通過旁分泌途徑促進(jìn)肝纖維化進(jìn)而促進(jìn)肝癌形成,另一方面是HSCs誘導(dǎo)免疫耐受,為肝癌細(xì)胞抵御了免疫系統(tǒng)的追蹤和清除。

HSCs誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制主要包括:(1)抑制T淋巴細(xì)胞增殖,促進(jìn)活化的T 淋巴細(xì)胞凋亡?；罨疶細(xì)胞本身及其分泌的細(xì)胞因子IFN-γ可促進(jìn)HSCs表達(dá)抑制性分子B7-H1,B7-H1可誘導(dǎo)活化T細(xì)胞自身的凋亡[2,8],此外,B7-H1可與T細(xì)胞表面受體PD-1結(jié)合,傳遞抑制性信號,增強(qiáng)免疫耐受[9];(2)抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用;(3)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生;(4)分泌具有誘導(dǎo)免疫耐受作用的細(xì)胞因子,如TGF-β1、B淋巴細(xì)胞趨化因子、粒細(xì)胞集落刺激因子等[10]。而Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)HSCs表達(dá)的TRAIL在保護(hù)同種異體移植的胰島免受排斥反應(yīng)中具有重要作用。在本研究中,我們也發(fā)現(xiàn)HSCs可明顯抑制T細(xì)胞增殖反應(yīng)。

TRAIL也被稱為凋亡素2配體,屬于Ⅱ型跨膜蛋白,是Wiley等[11]于1995年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族成員,是能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號分子之一。而凋亡常見于發(fā)生排斥的器官及組織,某些免疫抑制劑也通過誘導(dǎo)凋亡而發(fā)生抗排斥作用。研究發(fā)現(xiàn),TRAIL可能在促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡、維持免疫耐受等方面起著一定的作用[12],其發(fā)揮免疫抑制作用的途徑可能是作用于T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期,抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活化,或促進(jìn)活化T淋巴細(xì)胞的凋亡[13-14]。TRAIL及其受體結(jié)合,通過誘導(dǎo)凋亡來削弱活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞對移植物的攻擊,達(dá)到免疫耐受的效果,在移植免疫治療中發(fā)揮重要的作用。但TRAIL及其受體在誘導(dǎo)免疫耐受中的調(diào)控特點(diǎn)和作用機(jī)制等尚需進(jìn)一步闡明。

王曉敏等[15]研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ 可通過上調(diào)骨髓單個核細(xì)胞表面TRAIL及其受體DR5的表達(dá)來增強(qiáng) TRAIL與死亡受體的結(jié)合度,并進(jìn)一步增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡作用。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)IFN-γ可促進(jìn)HSCs高表達(dá)TRAIL且呈濃度依賴性,隨著IFN-γ濃度的遞增,HSCs的TRAIL表達(dá)量也在逐漸遞增,這與李松巖等[16]的研究結(jié)果相似,他們發(fā)現(xiàn)IFN-γ以濃度依賴的方式上調(diào) Jurkat 細(xì)胞TRAIL表達(dá)。但是,IFN-γ如何調(diào)控TRAIL的表達(dá)尚不清楚。

ATF5是轉(zhuǎn)錄激活因子/cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白家族的新成員,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡方面具有廣泛作用[17]。ATF5能與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子相互作用,形成復(fù)合物,共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,從而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡[18]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)IFN-γ作用于HSCs,HSCs中ATF5的表達(dá)亦增加,提示ATF5和TRAIL之間可能存在相關(guān)性。我們進(jìn)一步用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制HSCs中ATF5基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)ATF5的表達(dá)減少,TRAIL表達(dá)亦減少,提示ATF5基因的表達(dá)可促進(jìn)TRAIL的表達(dá)。使用IFN-γ作用于慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染的HSCs,發(fā)現(xiàn)抑制ATF5基因表達(dá)后,IFN-γ促進(jìn)TRAIL表達(dá)的作用明顯較弱,但TRAIL仍有一定的表達(dá)量,提示IFN-γ除了通過ATF5信號通路促進(jìn)TRAIL表達(dá),還存在其他信號通路促進(jìn)TRAIL的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn),胰島聯(lián)合HSCs共同移植到小鼠的腎包膜下,胰島得到明顯的保護(hù),與單獨(dú)胰島移植相比,胰島的存活期明顯延長;但胰島聯(lián)合慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染的HSCs共同移植到小鼠的腎包膜下,HSCs中ATF5基因表達(dá)受到抑制,TRAIL的表達(dá)減少,慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染的HSCs對T細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用減弱,對胰島的保護(hù)作用明顯下降,利用此體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證HSCs中ATF5可促進(jìn)TRAIL的表達(dá),TRAIL在誘導(dǎo)移植免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,小鼠HSCs中ATF5可促進(jìn)TRAIL基因表達(dá),表達(dá)TRAIL的HSCs可以抑制T細(xì)胞的增殖反應(yīng),此HSCs與胰島細(xì)胞聯(lián)合移植,明顯延長小鼠同種異體胰島移植物存活時間。TRAIL與相關(guān)受體結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用的具體機(jī)制,還有待我們進(jìn)一步研究。