張振強(qiáng) ，賈亞泉，王自闖，郭藝青，張金燕，李芹，宋軍營(yíng)

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，鄭州450046；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)

高脂血癥是一種全身性脂代謝紊亂性疾病，也是缺血性腦血管病的主要危險(xiǎn)因素。高血脂引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管舒張功能障礙，血管內(nèi)皮功能障礙能夠引起一氧化氮(NO)、血管內(nèi)皮素-1(ET-1)、前列環(huán)素(PGI2)、血漿血栓素(TXB2 )等血管調(diào)節(jié)因子的變化，進(jìn)而引起動(dòng)脈粥硬化和缺血性腦損傷[1，2]。缺血性腦損傷后血管新生主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化、細(xì)胞外基質(zhì)降解、管腔形成和毛細(xì)血管生成等[1]。NO、ET-1可共同維持血管張力，反映血管內(nèi)皮功能。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用的血管生成蛋白，CD34 是最敏感的新生血管內(nèi)皮標(biāo)記物[3，4]。有研究[3]表明，在高脂血癥狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能受損時(shí)血液VEGF 水平下降，且對(duì)缺血后腦組織仍有毒性作用。VEGF能夠通過(guò)刺激NO的作用顯著地增強(qiáng)血管的舒張，促進(jìn)受損內(nèi)皮功能的修復(fù)[4]。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥合并腦缺血患者血漿中vWFET-1、NO的表達(dá)水平低于單純腦缺血、高血脂患者?；低ńj(luò)湯由法半夏、橘紅、枳實(shí)、黃芪、丹參、山楂、川芎、雞血藤等中藥材配制而成，具有益氣活血，化瘀通絡(luò)之功效，對(duì)腦血管疾病具有一定的保護(hù)作用。目前關(guān)于化痰通絡(luò)湯對(duì)高脂血癥合并腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭械闹委熥饔孟嚓P(guān)報(bào)道罕見(jiàn)。2016年12月～2017年2月，我們觀察了化痰通絡(luò)湯預(yù)處理對(duì)高脂血癥合并腦缺血模型大鼠的治療作用，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)SD大鼠70只，雄性，體質(zhì)量(220±10)g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，質(zhì)量合格證號(hào)：37009200004690。化痰通絡(luò)湯加減[5](組成：法半夏12 g、橘紅10 g、枳實(shí)10 g、黃芪30 g、丹參25 g、山楂20 g、川芎12 g、雞血藤 18 g，以上八味水煎后，濃縮至相當(dāng)于原生藥材1.33 g /mL，備用)；檸檬酸(批號(hào)：20090306)和檸檬酸鈉(批號(hào)：20070403)均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。兔抗鼠VEGF和CD34單克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。試劑盒NO、ET-1和VWF試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程有限公司。酶標(biāo)儀(Thermo，型號(hào)1510)；洗板機(jī)(Thermo，型號(hào)：888)；顯微鏡(OLYMPUS，BX61)；切片機(jī)(LEICA，2245)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)FA/JA-B)；動(dòng)物血尿生化分析系統(tǒng)(IDEXX，Procyte DX)。

1.2 高脂血癥合并腦缺血模型制備與化痰通絡(luò)湯給予方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，斷尾取血檢測(cè)血脂四項(xiàng)值，每天給予高脂飼料(組成：3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)6周。分別于高脂飼養(yǎng)前、飼養(yǎng)6周時(shí)斷尾取血，檢測(cè)大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白降低(P均<0.05)，則說(shuō)明高脂血癥模型制備成功。將高脂血癥模型大鼠隨機(jī)分為高脂血癥對(duì)照組(正常組)15只、高脂血癥假手術(shù)組(假手術(shù)組)15只、高脂血癥合并腦缺血組模型組(模型組)20只、治療組20只，按預(yù)實(shí)驗(yàn)死亡率25% 計(jì)，保證造模成功后取材的動(dòng)物數(shù)共70只。飼養(yǎng)第7周開(kāi)始，治療組予化痰通絡(luò)方1.330 g/(kg·d)灌胃處理，正常組、假手術(shù)組和模型組予等體積生理鹽水，連續(xù)4周，每天1次。飼養(yǎng)第9周時(shí)，模型組和治療組根據(jù)Longa[6]報(bào)道的線栓法建制備腦缺血模型： 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中切口鈍性分離皮下組織，暴露暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎ECA、CCA，并穿線于ICA，用中號(hào)動(dòng)脈夾夾閉ICA。用眼科剪將CCA剪一小切口，由此迅速插入線栓，輕推線栓使之由頸總動(dòng)脈通過(guò)分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，至大腦中動(dòng)脈的起點(diǎn)，插入深度約18～22 mm，使其阻斷大腦中動(dòng)脈的血液供應(yīng)。手術(shù)過(guò)程中用白熾燈加熱維持動(dòng)物體溫。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與模型組相同，分離出左側(cè)的CCA、ECA、ICA，不結(jié)扎血管，不插入線栓。正常組大鼠不做任何處理。

1.3 各組大鼠 神經(jīng)系統(tǒng)功能及腦梗死體積測(cè)算 飼養(yǎng)11周時(shí)，5分制評(píng)分方法[6]評(píng)定模型組、治療組大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能。0分：無(wú)體征；1分：動(dòng)物右側(cè)下肢不能完全伸展；2分：右下肢癱瘓，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3分：肢體癱瘓，不能站立；4分：動(dòng)物昏迷，無(wú)自主性活動(dòng)。評(píng)級(jí)越高，大鼠的行為障礙越嚴(yán)重。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦組織，去掉小腦，-20 ℃冰箱冷凍20 min。取出腦組織第一刀切在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處，第二刀切在壞死區(qū)呈白色，未壞死區(qū)顏色呈淡紅色視交叉部位，第三刀切在漏斗柄部位，第四刀切在漏斗柄與后葉尾極之間，將腦組織切成5～6片，將切片置于1%四氮唑紅中，錫箔紙蓋住37 ℃避光染色10～30 min，4%多聚甲醛中固定，拍照觀察并測(cè)算腦組織壞死區(qū)面積，計(jì)算腦梗死體積比。腦梗死體積比=梗死體積/全腦體積×100%。

1.4 各組腦組織NO、ET-1和vWF檢測(cè) 采用ELISA法。飼養(yǎng)11周時(shí)，取各組大鼠，腹腔注射麻醉，斷頭取腦，去除嗅腦、腦干、小腦，用預(yù)冷的生理鹽水洗去表面殘血，用濾紙吸干表面殘液，稱重，用事先預(yù)冷的生理鹽水按質(zhì)量與體積比為1∶9的比例，冰浴下制備成10%的腦組織勻漿液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，ELISA法檢測(cè)腦組織中NO、ET-1和vWF的含量。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組大鼠腦組織VEGF、CD34檢測(cè) 采用免疫組化法。飼養(yǎng)11周時(shí)，取各組大鼠，麻醉后剪開(kāi)胸腔，充分暴露心臟。首先在右心耳剪一小口，從左心室先灌注生理鹽水，待大鼠前肢和兩肺變白，流出液澄清無(wú)血色，改用4%的多聚甲醛灌注固定。斷頭取出全腦，除去小腦，4% 的多聚甲醛固定保存，石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟脫水；用3 % H2O2室溫下7 min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次；熱修復(fù)抗原，PBS洗2次；滴加5% BSA封閉液，室溫20 min；分別滴加相應(yīng)稀釋的一抗(VEGF和CD34均為1∶400)，4 ℃過(guò)夜，PBS洗3次；滴加二抗37 ℃孵育20 min，PBS洗3次；滴加SABC，37 ℃孵育20 min，PBS洗4次；DAB顯色，反應(yīng)7 min左右，蒸餾水清洗；蘇木素復(fù)染，1 %的鹽酸酒精分化1 s，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro-Plus 7.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)其平均光密度值。以平均光密度值代表VEGF、CD34的陽(yáng)性表達(dá)量。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 治療組、模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比比較 治療組與模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別為(1.63±0.20)、(3.11±0.22)分，二者比較，P<0.05。治療組與模型組大鼠腦梗死體積比分別為16.82%±7.18%、32.97%±9.86%，二者比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織NO、ET-1、vWF含量比較

注：與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽(yáng)性表達(dá)量比較 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽(yáng)性表達(dá)量比較見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織VEGF、CD34陽(yáng)性表達(dá)量比較

注：與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，高脂血癥合并腦缺血的核心病機(jī)為痰瘀阻絡(luò)，痰濁和瘀血同時(shí)又是臟腑功能失調(diào)、氣血津液代謝失常的病理產(chǎn)物，治以化痰祛瘀通絡(luò)，即“痰化癖去，腦絡(luò)暢達(dá)，氣血流通，疾病方能向愈”。化痰通絡(luò)方藥由法半夏、橘紅、枳實(shí)、黃芪、丹參、山楂、川芎、雞血藤八味藥組成。半夏化痰，雞血藤活血通絡(luò)；川芎血中氣藥，丹參味涼血活血，二藥合用具有行氣活血祛瘀之作用；橘紅理氣化痰，枳殼行氣解郁，黃芪健脾益氣，山楂活血消食，食積亦為痰瘀之源，諸藥合用可謂標(biāo)本同治。

近年來(lái)，中藥治療對(duì)腦缺血后的血管新生影響的研究也漸成為研究熱點(diǎn)。缺血區(qū)微血管的新生對(duì)于腦卒中的治療和神經(jīng)功能恢復(fù)至關(guān)重要，腦缺血后血管新生機(jī)制復(fù)雜，由多種促血管生長(zhǎng)因子參與。VEGF是主要的調(diào)控因子，能夠作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性多功能因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及毛細(xì)血管瓣的生成，從而促進(jìn)新生血管的生成，VEGF還通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡蛋白表達(dá)維持新生血管中內(nèi)皮細(xì)胞的生存[7～10]。CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，可作為檢測(cè)微血管密度的首選標(biāo)志物[11，12]。新形成的側(cè)枝血管可改善缺血區(qū)周圍的組織灌流及腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)[13]。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織VEGF、CD34表達(dá)增加，化痰通絡(luò)方藥作用后VEGF和CD34的表達(dá)增加更顯著，而且神經(jīng)功能評(píng)分降低，缺血面積減少。這表明化痰通絡(luò)方藥能夠預(yù)防性治療高脂血癥合并腦缺血引起的大鼠腦組織損傷，并通過(guò)對(duì)血管調(diào)節(jié)因子VEGF和CD34表達(dá)的上調(diào)發(fā)揮作用，修復(fù)高脂血癥條件下的缺血組織邊緣區(qū)血管內(nèi)皮功能。也有研究[14～16]表明，VEGF表達(dá)的增加能夠VEGF減少腦梗死面積、減輕腦水腫、促進(jìn)受損內(nèi)皮功能的修復(fù)的作用，說(shuō)明血管調(diào)節(jié)因子在高脂血癥條件下的缺血不同時(shí)期既有累積現(xiàn)象又有特異性的表達(dá)，可能有助于腦缺血恢復(fù)期損傷的修復(fù)[1]。

本研究結(jié)果還顯示，治療組腦組織NO含量顯著增加，ET-1和vWF含量顯著降低，提示化痰通絡(luò)方藥在修復(fù)高脂血癥條件下的缺血腦組織的血管內(nèi)皮功能障礙方面具有重要作用。vWF是關(guān)鍵的參與缺血性腦中風(fēng)的因素，當(dāng)腦組織發(fā)生缺血時(shí)，vWF表達(dá)明顯增加。也有研究[1]發(fā)現(xiàn)，ET-1/ NO表達(dá)量下降，可能有利于腦缺血損傷的恢復(fù)。NO 是許多血管生長(zhǎng)因子的下游介質(zhì)，所以能夠與VEGF相互協(xié)調(diào)共同作用促進(jìn)血管新生[17]，但這個(gè)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，化痰通絡(luò)湯預(yù)先灌胃的合并高脂血癥腦缺血大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能、腦梗死體積均減少，其機(jī)制可能為促進(jìn)腦組織NO、VEGF、CD34表達(dá)，降低ET-1和vWF含量。