国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

小鼠髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-2基因小發(fā)卡狀RNA慢病毒載體構(gòu)建

2018-12-13 11:56:10冉江霞石勝良王成志
山東醫(yī)藥 2018年43期
關(guān)鍵詞:滴度膠質(zhì)載體

冉江霞,石勝良,王成志

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,南寧 530007;2 廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的老年變性疾病,遲發(fā)型阿爾茨海默病(LOAD)是其重要分型。LOAD的發(fā)病核心與基礎(chǔ)是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)異常集聚以及由其引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。針對Aβ的免疫性治療清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Aβ一直被認(rèn)為是治療AD的關(guān)鍵,但嚴(yán)重的不良反應(yīng)導(dǎo)致治療效果不佳[1]。髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(TREM2)是免疫球蛋白超家族中的一個受體家族。研究[2,3]認(rèn)為,髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-2(TREM2)在介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ吞噬和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)炎癥中有重要作用,與LOAD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但其具體作用機(jī)制尚不明確。AD患者腦組織TREM2基因高表達(dá)[4],尤其是Aβ斑塊周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞[2,5,6],并與腦組織Aβ含量呈正相關(guān)[7,8]。因此,闡明TREM2的具體作用機(jī)制可能為AD的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。2017年12月~2018年5月,我們構(gòu)建了TREM2基因小發(fā)卡狀RNA(shRNA)慢病毒表達(dá)載體(TREM2-shRNA),并檢測其對小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2基因的沉默效果,旨在為后續(xù)細(xì)胞水平研究TREM2在LOAD發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院饋贈。大腸埃希菌菌株DH5α、293T細(xì)胞、慢病毒載體GV248、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體、Age I及dsDNA oligo購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司;Primer購于捷瑞生物公司;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和Opti-MEM購于Gibco公司;Plasmid抽提試劑盒購于天根生化公司;EcoR Ⅰ和T4 DNA連接酶購于Thermo Scientific公司;Taq聚合酶購于Vazyme公司;RNA抽提試劑TRIzol購于Invitrogen公司;cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購于TAKARA公司。

1.2 TREM2-shRNA的構(gòu)建、鑒定

1.2.1 TREM2-shRNA的構(gòu)建 針對GenBank中小鼠TREM2基因的mRNA序列(NM_031254)設(shè)計(jì)3個RNA干擾( RNAi)靶點(diǎn)序列,分別為①5′-TTGCTGGAACCGTCACCAT-3′;②5′-AGAGGCTGAGGTCCTGCAGAA-3′;③5′-AGCGGAATGGGAGCACAGTCA-3′。同時設(shè)計(jì)陰性對照插入序列:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。根據(jù)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的編碼shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA模板鏈及其互補(bǔ)序列(表1),由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。將以上互補(bǔ)鏈經(jīng)退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后的線性化GV248載體連接。反應(yīng)體系如下:100 ng/μL線性化載體1 μL,100 ng/μL雙鏈DNA 1 μL,T4 DNA連接酶1 μL,10×T4 DNA連接酶緩沖液2 μL,加ddH2O至20 μL,16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α,取適量菌液接種至LB固體培養(yǎng)基平板上,孵育過夜。挑取陽性重組克隆TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3送上海美季生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果顯示,合成的TREM2 shRNA1、shRNA2、shRNA3寡核苷酸序列均已成功插入載體中,無突變且位置正確,與預(yù)先設(shè)計(jì)完全一致。

表1 TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3的引物序列

1.2.2 TREM2-shRNA的包裝及滴度測定 分別將TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-320 μg、包裝質(zhì)粒pHelper 1.0載體15 μg、pHelper 2.0載體10 μg與相應(yīng)體積的吉凱轉(zhuǎn)染試劑混勻使其總體積為1 mL,共轉(zhuǎn)染密度為70%~80%的293T細(xì)胞。培養(yǎng)6 h換成完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(GFP)情況,培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞上清,對其進(jìn)行超速離心沉淀得到高滴度的慢病毒濃縮液,-80 ℃保存?zhèn)溆?。滴度測定前1天,將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以約4×104/孔接種于96孔板中;用培養(yǎng)基以10倍梯度逐孔稀釋病毒原液為6個濃度(100~10-5),用不同濃度的病毒液感染293T細(xì)胞,培養(yǎng)24 h更換為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)4 d,熒光顯微鏡下觀察GFP情況,測算病毒滴度。病毒滴度(TU/mL)=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

1.3 TREM2-shRNA對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TREM2表達(dá)的影響觀察

1.3.1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分組及 TREM2-shRNA感染 取對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,5×104/孔接種于24孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞密度約70%時,將細(xì)胞分為TREM2-shRNA-1感染組、TREM2-shRNA-2感染組、TREM2-shRNA-3感染組、陰性對照組及空白對照組5組,每組6個復(fù)孔,TREM2-shRNA-1感染組、TREM2-shRNA-2感染組、TREM2-shRNA-3感染組、陰性對照組分別感染TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3、shRNA空質(zhì)粒,以感染復(fù)數(shù)=80感染細(xì)胞,培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基,空白組不做任何處理。TREM2-shRNA-1感染組、TREM2-shRNA-2感染組、TREM2-shRNA-3感染組感染120 h在熒光顯微鏡下均觀察到GFP,且感染效率均達(dá)95%以上,提示慢病毒感染成功。

1.3.2 各組細(xì)胞TREM2 mRNA檢測 感染120 h取各組細(xì)胞,裂解提取總RNA,合成cDNA,Q-PCR法檢測各組TREM2 mRNA。TREM2上游引物:5′-AGCCTACCACCTTCCTCCTCT-3′,下游引物:5′-TCACGTACCTCCGGGTCCAGT-3′。β-actin上游引物為:5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′,下游引物:5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′。反應(yīng)體系,上游引物(0.7 μmol/L)0.7 μL,下游引物(0.7 μmol/L)0.7 μL,cDNA 1.0 μL,2x SYBR Green Mix 5 μL,ROX 0.5 μL,加RNase-free water至10 μL。反應(yīng)條件95 ℃ 預(yù)變性2 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。采以2-△△Ct代表TREM2 mRNA的相對表達(dá)量。計(jì)算細(xì)胞沉默效率,沉默效率=(1-重組慢病毒載體組TREM2 mRNA相對表達(dá)量/空白對照組TREM2 mRNA相對表達(dá)量)×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果

TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h熒光顯微鏡下均可觀察GFP,證實(shí)病毒包裝成功。經(jīng)計(jì)算,TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2和TREM2-shRNA-3的滴度分別為(4×108)、(4×108)、(5×108)TU/mL。TREM2-shRNA-1感染組、TREM2-shRNA-2感染組、TREM2-shRNA-3感染組、陰性對照組及空白對照組TREM2 mRNA相對表達(dá)量分別為49.4%±3.98%、79.7%±2.01、65.3%±2.41%和39.2%±6.98%,與空白對照組和陰性對照組比較,TREM2-shRNA-1感染組、TREM2-shRNA-2感染組、TREM2-shRNA-3感染組TRME2 mRNA相對表達(dá)量均降低(P均<0.05);與REM2-shRNA-1感染組、T、TREM2-shRNA-3感染組比較,REM2-shRNA-2感染組TRME2 mRNA相對表達(dá)量降低(P均<0.05)。TREM2-shRNA-1感染組、TREM2-shRNA-2感染組、TREM2-shRNA-3感染組、陰性對照組的沉默效率分別為49.4%±3.98%、79.7%±2.01、65.3%±2.41%和39.2%±6.98%,TREM2-shRNA-2感染組沉默效率最高。

3 討論

TREM2基因位于小鼠染色體17C3上,包括5個外顯子結(jié)構(gòu),編碼一個跨膜糖蛋白受體,屬于免疫球蛋白-凝集素樣超家族受體的成員。它由胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾部組成。酪氨酸激酶結(jié)合蛋白常與TREM2的跨膜區(qū)域相互作用并且通過其胞質(zhì)免疫受體酪氨酸激活基序來招募蛋白酪氨酸激酶(Syk)。Syk啟動比如Ca2+動員、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶激活等一系列信號事件[9],這些信號促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、吞噬和炎癥調(diào)節(jié)。TREM2廣泛分布于腦內(nèi),以白質(zhì)、海馬和新皮質(zhì)最多,并主要表達(dá)于髓樣細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[10]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,TREM2僅存在于小膠質(zhì)細(xì)胞上[11]。因此,通過沉默TREM2在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá),來研究TREM2是通過何種通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ的吞噬并抑制中樞炎癥反應(yīng)是非常有必要的,對于探索TREM2基因在LOAD中的作用機(jī)制十分重要。

研究目的基因在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮重要作用及其相關(guān)分子機(jī)制通常需要觀察細(xì)胞中目的基因沉默后其下游基因蛋白表達(dá)變化和細(xì)胞生物學(xué)行為變化,RNAi正扮演著這樣一個重要角色。RNAi是利用雙鏈RNA與靶基因mRNA特異性結(jié)合,引起同源基因特異性降解的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。常被用于RNA干擾的是shRNA,它是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列。RNAi技術(shù)作為新興的基因阻斷技術(shù)在基因功能和相關(guān)方面的研究具有許多傳統(tǒng)反義技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢:高度特異性、高效性、高穩(wěn)定性、快速性、可遺傳性和可傳播性等[12]。目前,RNAi已成為研究功能基因組學(xué)、基因治療、信號傳導(dǎo)通路分析和藥物靶點(diǎn)篩選等熱門領(lǐng)域的強(qiáng)有力工具。

RNAi的有效性主要由基因轉(zhuǎn)移的效率決定。目前,基因轉(zhuǎn)移技術(shù)有多種,常用的有質(zhì)粒和病毒載體。質(zhì)粒作為載體介導(dǎo)RNAi轉(zhuǎn)染時,存在轉(zhuǎn)染效率低、對基因的抑制表達(dá)作用弱、作用持續(xù)時間短、無法轉(zhuǎn)染非分裂相細(xì)胞等缺點(diǎn),因而,在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。病毒載體中,慢病毒載體近幾年來受到了科研工作者們的青睞。慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,是在HIV-Ⅰ基礎(chǔ)上改造成的病毒載體系統(tǒng)。慢病毒載體充分發(fā)揮了自身所具備的優(yōu)勢,比如病毒效價(jià)高、生物安全性高、感染譜廣、感染效率高、容納目的基因片段大、目的基因表達(dá)持久穩(wěn)定和免疫反應(yīng)小等[13~15]。這些優(yōu)勢使慢病毒載體成為RNAi的首選載體[16]。因此,本實(shí)驗(yàn)采取GV248慢病毒載體,該載體中含有U6啟動子,在宿主細(xì)胞中能持續(xù)表達(dá)有干擾作用的shRNA;該載體還含有IRES和Ubiquitin啟動子,且它們后面分別緊接puromycin和EGFP,這使得該載體感染目的細(xì)胞后,puromycin和EGFP能更高效地表達(dá),有利于后續(xù)使用嘌呤霉素對細(xì)胞進(jìn)行篩選和對感染效率進(jìn)行觀察。本研究構(gòu)建了TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3等3種小鼠TREM2基因shRNA慢病毒表達(dá)載體,并均通過測序鑒定,經(jīng)包裝產(chǎn)生慢病毒的滴度達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。由于病毒對小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的感染效率顯著高于siRNA和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率,因此,本研究使用包裝后的慢病毒感染小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行有效靶點(diǎn)的篩選。3種小鼠TREM2基因shRNA慢病毒表達(dá)載體感染小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后,熒光顯微鏡下觀察,感染效率可達(dá)95%以上;TREM2 mRNA相對表達(dá)量均下降,篩選出沉默效果最佳的TREM2-shRNA-2,對TREM2基因mRNA表達(dá)的沉默效率可達(dá)79.7%。

綜上所述,成功構(gòu)建TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3。TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3均可沉默小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2基因表達(dá),以TREM2-shRNA-2沉默效果最好。

猜你喜歡
滴度膠質(zhì)載體
創(chuàng)新舉措強(qiáng)載體 為僑服務(wù)加速跑
華人時刊(2022年9期)2022-09-06 01:02:44
不同富集培養(yǎng)方法對噬菌體PEf771的滴度影響
重組腺相關(guān)病毒基因藥物三種滴度的比較與分析
自身免疫性肝病診斷中抗核抗體與自身免疫性肝病相關(guān)抗體檢測的應(yīng)用價(jià)值
堅(jiān)持以活動為載體有效拓展港澳臺海外統(tǒng)戰(zhàn)工作
華人時刊(2020年15期)2020-12-14 08:10:36
人類星形膠質(zhì)細(xì)胞和NG2膠質(zhì)細(xì)胞的特性
視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的研究進(jìn)展
TiO_2包覆Al_2O_3載體的制備及表征
側(cè)腦室內(nèi)罕見膠質(zhì)肉瘤一例
磁共振成像(2015年1期)2015-12-23 08:52:21
慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA,HBeAg和ALT滴度與恩替卡韋療效的關(guān)系
甘泉县| 山阴县| 宣威市| 康保县| 新营市| 开阳县| 右玉县| 上思县| 香港| 仁布县| 黄冈市| 天气| 合肥市| 会昌县| 襄城县| 沅江市| 关岭| 铜川市| 延川县| 梓潼县| 田东县| 鹤峰县| 寿宁县| 瑞昌市| 淮安市| 肇东市| 肃宁县| 大城县| 米易县| 科技| 无棣县| 邳州市| 会东县| 嵊泗县| 永善县| 综艺| 章丘市| 广元市| 平利县| 浦县| 洞口县|