梅承翰，莊慧敏，劉師卜，牛厚菊，劉婷

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直接肽反應(yīng)試驗(yàn)及其研究進(jìn)展

梅承翰，莊慧敏，劉師卜，牛厚菊，劉婷

550016 貴陽，貴州省分析測(cè)試研究院應(yīng)用基礎(chǔ)研究室（梅承翰、牛厚菊）；550004 貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)處統(tǒng)計(jì)室（莊慧敏）；100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院食品檢定所毒理功效實(shí)驗(yàn)室（梅承翰、劉師卜、牛厚菊、劉婷）

變應(yīng)性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是人類最常見的免疫毒性疾病之一。據(jù)估計(jì) 15% ~ 20% 的人會(huì)對(duì)一到多個(gè)市場(chǎng)中的化學(xué)品皮膚過敏[1]。支持皮膚致敏過程并最終導(dǎo)致 ACD 的關(guān)鍵機(jī)理事件已被闡釋清楚。經(jīng)濟(jì)與合作發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）報(bào)告中將其定義為有害結(jié)局通路（adverse outcome pathway，AOP）[2]。皮膚致敏性評(píng)價(jià)作為物質(zhì)安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分并代表了化學(xué)品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。近年來，特別是歐洲國(guó)家，發(fā)展替代方法用以取代動(dòng)物試驗(yàn)的社會(huì)、科學(xué)和經(jīng)濟(jì)的壓力顯著增加。為此，眾多研究者開發(fā)基于肽或蛋白反應(yīng)活性的方法用以篩選并鑒定潛在皮膚致敏物質(zhì)，其中包括直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)（direct peptide reactivity assay，DPRA）。DPRA 立足于 AOP 中的分子起始事件，通過監(jiān)測(cè)待測(cè)物對(duì)半胱氨酸和賴氨酸多肽的消除從而評(píng)估待測(cè)物的致敏性，其準(zhǔn)確度和靈敏度較高，并易于操作。2013 年歐洲替代方法研究中心將 DPRA 推薦為皮膚致敏試驗(yàn)的方法，今已被 OECD 接受并公布[3]。該文將從 DPRA 的原理、局限性、優(yōu)化發(fā)展和與其他替代方法的整合等方面作詳細(xì)介紹。

1 基本原理

化學(xué)品與皮膚中蛋白的親核中心共價(jià)結(jié)合，此即為皮膚致敏有害結(jié)局通路中的分子起始事件，若無該事件，則皮膚致敏一般不會(huì)發(fā)生[4]。因此如化學(xué)品可直接或經(jīng)適當(dāng)生物轉(zhuǎn)化后與蛋白反應(yīng)，便具有潛在皮膚致敏性。上述反應(yīng)產(chǎn)物刺激朗格罕細(xì)胞從表皮向局部皮膚引流淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并將抗原呈遞至初始型 T 細(xì)胞，導(dǎo)致抗原特異性記憶 T 細(xì)胞克隆增殖，最終導(dǎo)致 ACD 臨床表征[5]。皮膚致敏物或其代謝產(chǎn)物的親電子性，使其可與含親核位點(diǎn)的蛋白反應(yīng)。DPRA 利用含半胱氨酸和賴氨酸的多肽作為親核試劑。待測(cè)物與上述多肽共孵育后，以高效液相色譜法檢測(cè)多肽的消除程度并以此來評(píng)估待測(cè)物的反應(yīng)能力。將多肽反應(yīng)數(shù)據(jù)與已有的局部淋巴結(jié)分析（local lymaph node assay，LLNA）數(shù)據(jù)作對(duì)比，并用遞歸區(qū)分方法建立分類樹，從而將反應(yīng)程度分為極小、低、中和高四等[6]。最后將極小反應(yīng)性歸為非致敏物，其他為致敏物。

2 直接肽反應(yīng)試驗(yàn)的局限

盡管直接肽反應(yīng)試驗(yàn)準(zhǔn)確度高、靈敏度高，且便于批量化檢測(cè)，但仍存在局限。這些局限一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用，當(dāng)然這也是 DPRA 需要重點(diǎn)關(guān)注的地方。DPRA 以及許多其他用于皮膚致敏性評(píng)價(jià)的化學(xué)方法不能反映代謝活化或非生物轉(zhuǎn)化[7]，此為 DPRA 的主要缺陷之一。Pro-半抗原（pro-hapten）需要經(jīng)過酶介導(dǎo)活化后，才可形成蛋白反應(yīng)抗原，激發(fā)皮膚致敏。因而 DPRA 對(duì)于 pro-半抗原的致敏性預(yù)測(cè)存在困難，甚至無法預(yù)測(cè)。

直接肽反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)的估計(jì)依賴于對(duì)未反應(yīng)多肽的檢測(cè)，并可能受到不同親水親核試劑和疏水致敏物的影 響[8]。大多數(shù)皮膚過敏原水溶性較差，因而在與另一溶液混合時(shí)，可能析出沉淀，從而影響對(duì)肽反應(yīng)的定量和結(jié)果分 級(jí)[9]。可見 DPRA 對(duì)待測(cè)物溶解性要求較高，此外溶劑的選擇也需考量并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí) DPRA 對(duì)待測(cè)物濃度要求較高，在基于賴氨酸多肽（25 mmol/L）的檢測(cè)方法中尤為明顯，因而限制了高疏水性待測(cè)物的應(yīng)用[10]。DPRA 檢測(cè)中要求將待測(cè)物配制成 100 mmol/L 溶液，這在一定程度上限制了溶解性差的待測(cè)物的應(yīng)用。

DPRA 對(duì)于混合物特別是含未知成分混合物的致敏性預(yù)測(cè)存在困難。DPRA主要是針對(duì)單一化學(xué)品，而對(duì)復(fù)雜組分致敏性預(yù)測(cè)未有詳細(xì)界定和全方位評(píng)估。當(dāng)然 DPRA 也并非完全不能用于混合物，OECD TG442C 寫明了在針對(duì)成分已知的多組分時(shí)，需要根據(jù)各自組分的含量計(jì)算所需物質(zhì)的重量（單一純度）；或計(jì)算混合物表觀分子量，以評(píng)價(jià)混合物致敏性。另外對(duì)于無法確定分子量的聚合物，可考慮通過其單體分子量計(jì)算配制 100 mmol/L 溶液所需的量。有文獻(xiàn)報(bào)道，研究人員應(yīng)用 DPRA 對(duì)中藥注射劑和植物提取物進(jìn)行致敏性評(píng)價(jià)[11-12]。該方法將中藥注射劑原液直接與多肽進(jìn)行孵育，并未考慮混合物成分及其對(duì)應(yīng)濃度。一方面這是對(duì) DPRA 應(yīng)用拓展的有益嘗試，另一方面也提示研究人員需要對(duì) DPRA 應(yīng)用于復(fù)雜組分混合物作進(jìn)一步評(píng)估。

3 直接肽反應(yīng)試驗(yàn)的優(yōu)化

直接肽反應(yīng)試驗(yàn)一經(jīng)推出，便受到廣大研究人員和相關(guān)產(chǎn)業(yè)人員的關(guān)注。雖然 DPRA 優(yōu)點(diǎn)明顯，潛力巨大，但仍有其局限。為此研究人員立足于肽反應(yīng)試驗(yàn)的本質(zhì)，從多肽、代謝體系、檢測(cè)方法等方面進(jìn)行探索和優(yōu)化，力圖建立高準(zhǔn)確度、高靈敏度、特異性強(qiáng)和檢測(cè)快捷的肽反應(yīng)試驗(yàn)方法。

HTS-DYCA（high throughput screening-dansyl cysteamine assay）是基于熒光半胱氨酸衍生物-新型化學(xué)高通量篩選方法對(duì)潛在皮膚親電子致敏劑進(jìn)行快速識(shí)別的方法[8]。DYCA 直接在多孔微反應(yīng)板中對(duì)形成的半抗原-硫醇類蛋白質(zhì)加合物進(jìn)行熒光檢測(cè)[8]。研究表明，在限定的致敏劑測(cè)試中，DYCA 和 DPRA 在準(zhǔn)確度方面分別達(dá)到 81.8% 和 92.8%[8]。此外 DYCA 和 DPRA 均不能檢測(cè)出公認(rèn)的 pre/pro-半抗原，如對(duì)苯二酚、間苯二酚和羥基酪醇[8]。此外，DYCA 對(duì)溶解度和氧化副反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，并采用高通量化檢測(cè)以大幅縮短檢測(cè)時(shí)間[8]。

過氧化物酶肽反應(yīng)法（peroxidase peptide reactivity assay，PPRA）融合了劑量響應(yīng)分析、肽消除質(zhì)譜檢測(cè)和辣根過氧化物酶-過氧化氫酶（HRP/P）體系[13]，強(qiáng)化了對(duì) pro/pre-半抗原的識(shí)別，調(diào)整和優(yōu)化了 DPRA。HRP/P 加入多肽孵育體系后，使 DPRA 檢測(cè) pro-半抗原成為了可能。Troutman 等[7]研究表明，與 DPRA 相比，HRP/P 與 pre/pro-半抗原、半胱氨酸多肽共孵育，顯著增強(qiáng)了 4-羥基苯甲酸、苯甲酸和對(duì)羥基苯甲酸丙酯的肽消除。酶介導(dǎo)激活 pro-半抗原后導(dǎo)致半胱氨酸多肽消除增加，最大消除值增加 20% ~ 100% 不等。然而對(duì)于 pre-半抗原，有無 HRP/P 加入，半胱氨酸多肽消耗無明顯差異。應(yīng)用 PPRA 對(duì) 70 個(gè)待測(cè)物進(jìn)行評(píng)估，其準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性分別達(dá)到 83%、93% 和 64%[7]。然而待測(cè)物的溶解性和合適的測(cè)試濃度仍是 PPRA 面臨的難題和挑戰(zhàn)。替代方法對(duì)于識(shí)別致敏危害和提供正確的效力分級(jí)（弱、中等、強(qiáng)）都很重要。DPRA 和 PPRA 均可能有助于致敏效力評(píng)估，如提供整合方法、根據(jù)致敏物 GHS（Globally Harmonized System）分類或根據(jù)評(píng)估目的來確定致敏效力等[4]。此外也有研究人員將 PPRA 用于預(yù)測(cè)呼吸道致敏物。研究發(fā)現(xiàn)，PPRA 對(duì)具有內(nèi)在活性的呼吸道致敏物的預(yù)測(cè)與 DPRA 類似，但未能將呼吸道 pre/pro-半抗原雙氯苯雙胍己烷、乙二胺和二乙烯二胺準(zhǔn)確識(shí)別[14]。

Fujita 等[15]通過對(duì)氨基酸衍生物進(jìn)行優(yōu)化，使用 N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L-cysteine（NAC）和 α-N-(2-(1- naphthyl)acetyl)-L-lysine（NAL）取代 DPRA 中的半胱氨酸多肽或賴氨酸多肽，開發(fā)出了氨基酸衍生物反應(yīng)法（amino acid derivative reactivity assay，ADRA）。研究人員應(yīng)用 ADRA 對(duì) 88 個(gè)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確度達(dá) 88%，與 DPRA 類似。后續(xù)研究人員又對(duì)氨基酸衍生物溶液的 pH、待測(cè)物/氨基酸衍生物比率等進(jìn)行了優(yōu)化。ADRA 靈敏度高，因而待測(cè)物的濃度可由 100 mmol/L 降低至 1 mmol/L，這使得易于制備一些溶解性差的待測(cè)物。此外 NAC/NAL 因其對(duì)待測(cè)物濃度要求較低，待測(cè)物不太可能出現(xiàn)沉淀和產(chǎn)生渾濁，預(yù)計(jì)定量更加準(zhǔn)確[15]。ADRA 方法優(yōu)化后，準(zhǔn)確度高達(dá) 90%（82 個(gè)待測(cè)物）[15]。

4 與其他替代實(shí)驗(yàn)方法的聯(lián)合運(yùn)用

單一的非動(dòng)物替代試驗(yàn)不足以完全覆蓋皮膚致敏有害結(jié)局通路，也不能完全取代動(dòng)物試驗(yàn)，因而越來越多研究?jī)A向于聯(lián)合各替代方法以彌補(bǔ)各自的局限，并爭(zhēng)取覆蓋盡可能多的皮膚致敏有害結(jié)局通路事件。最少兩個(gè)關(guān)鍵事件的組合，如蛋白結(jié)合和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）激活，使其在皮膚致敏中相關(guān)性更強(qiáng)，增強(qiáng)互補(bǔ)，因而提升了預(yù)測(cè)能力。

表 1 整合測(cè)試策略致敏性預(yù)測(cè)

注：*LLNA 致敏物（102），LLNA 非致敏物（37）；#LLNA 致敏物（76），LLNA 非致敏物（25）；&LLNA 致敏物（77），LLNA 非致敏物（26）。

表 2 整合測(cè)試策略致敏效力預(yù)測(cè)

注：*LLNA：極強(qiáng) + 強(qiáng)致敏（29），中等 + 弱致敏（73），未分級(jí)（37）；#LLNA：極強(qiáng) + 強(qiáng)致敏（24），中等 + 弱致敏（52），未分級(jí)（25）；&LLNA：極強(qiáng) + 強(qiáng)致敏（23），中等 + 弱致敏（54），未分級(jí)（26）。

4.1 集成檢測(cè)策略

研究人員通過組合 139 個(gè)化學(xué)品的物理化學(xué)信息、LLNA、h-CLAT（human cell line activation test）、DPRA、DEREK 數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)具有綜合性、多樣性、高質(zhì)量特點(diǎn)的數(shù)據(jù)集[16]。基于上述數(shù)據(jù)集，研究人員精煉了集成檢測(cè)策略（integrated testing strategy，ITS）和次序檢測(cè)策略（sequential testing strategy，STS）。如表 1 和表 2 所示，就預(yù)測(cè)而言集成檢測(cè)策略與 LLNA 相比，危害識(shí)別準(zhǔn)確高達(dá) 84%，效力分類準(zhǔn)確度達(dá) 71%。與之類似，STS 準(zhǔn)確度分別達(dá)到 81% 和 69%[16]。當(dāng)排除 low Kow > 3.5 的待測(cè)物后，ITS 和 STS 的預(yù)測(cè)表現(xiàn)進(jìn)一步提升。ITS 和 STS 與單用 h-CLAT 或 DPRA 相比，準(zhǔn)確度更高，分別為 84% 和 81%[16]。Jaworska 等[19]基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建了 ITS-3，并拓展了應(yīng)用范圍。ITS-3 可用于危害性識(shí)別、GHS 分級(jí)、定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等。該方法相較于 ITS-2 提高了準(zhǔn)確度、精密度，優(yōu)化了預(yù)測(cè)性。

4.2 分層測(cè)試策略

研究人員將 QSARs（quantitative structure-activity relationships）、DPRA、KeratinoSens、Gene signature、h-CLAT等按圖 1 所示分成 3 個(gè)層次，并按照?qǐng)D示規(guī)則進(jìn)行評(píng)估[20]。該策略有效彌補(bǔ)了各單一方法的不確定性，并正確地區(qū)分出所測(cè) 41 個(gè)待測(cè)物。然而該法可能無法識(shí)別出其他未參與測(cè)試的 pro-半抗原。因?yàn)樵摬呗詢H第二層的 HaCaT 細(xì)胞有一些代謝能力，而其他層面的代謝能力不足甚至缺失[20]。Pro-半抗原僅能在第二層被識(shí)別，因而可能無法正確區(qū)分這類物質(zhì)的致敏性。未來可將 DPRA 更換成具有代謝能力的 PPRA 或在 KeratinoSens 中加入 S9 代謝部分以彌補(bǔ)該缺陷。此外，分層測(cè)試策略的另一局限是無法評(píng)估化學(xué)品的致敏效力。效力可通過高級(jí)統(tǒng)計(jì)方法，如定量機(jī)械模型、貝葉斯統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行評(píng)估。分層測(cè)試策略一方面可能減少假陰性結(jié)果，另一方面卻可能提升假陽性結(jié)果，此外其靈敏度較高，特異性較低。

Kimura 等[18]將 IL-8 Luc 法與 DPRA 組合成分層預(yù)測(cè)法，并對(duì) 103 個(gè)待測(cè)物進(jìn)行了評(píng)估。IL-8 Luc 法靈敏度高、適合于強(qiáng)致敏劑的檢測(cè)，故作為第一層次。而對(duì)于 IL-8 Luc 檢測(cè)不出的弱和中等致敏劑則采用 DPRA 評(píng)估。如表 1 所示，該層次預(yù)測(cè)法靈敏度高達(dá) 96.1%（74/77），準(zhǔn)確度高達(dá) 87.4%（90/103）[18]。更重要的是 IL-8 Luc 和 DPRA 層次預(yù)測(cè)法可區(qū)分出 54 個(gè) LLNA 中定義為弱或中等致敏劑中的 51 個(gè)（表 2）。在另一項(xiàng)研究中，研究人員將 h-CLAT 和 DPRA 組合成分層系統(tǒng)，該預(yù)測(cè)系統(tǒng)靈敏度高達(dá) 96%，準(zhǔn)確度達(dá) 86%（表 1）[17]。

4.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析是一種非線性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)建模工具，用于建模輸入和輸出的復(fù)雜關(guān)系，并且具有類似神經(jīng)的學(xué)習(xí)能力。該模型運(yùn)用多個(gè)由體外致敏實(shí)驗(yàn)而來的參數(shù)進(jìn)行組合，旨在進(jìn)一步提升預(yù)測(cè)性能。參數(shù)涵蓋 h-CLAT、DPRA、SH test 以及抗氧化反應(yīng)元件測(cè)定法（antioxidant response element assay）等[21]。研究表明，在兩兩組合中，應(yīng)用 h-CLAT/DPRA 的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型比 DPRA/抗氧化反應(yīng)元件測(cè)定法或 SH test/抗氧化反應(yīng)元件測(cè)定法，LLNA 閾值相關(guān)性更好[21]。此外模型參數(shù)的增加有助于減少假陰性結(jié)果。三參數(shù)模型相較兩參數(shù)模型，值更好，RMS error 更低[21]?；瘖y品成分復(fù)雜多樣，其組分物理性質(zhì)不盡相同，如水溶性、脂溶性、硅溶性、分子量、多聚物、植物提取物等。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型有望發(fā)展成一個(gè)非動(dòng)物皮膚致敏性評(píng)價(jià)系統(tǒng)以覆蓋盡可能多的化妝品。

4.4 基于分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)系統(tǒng)

研究人員同樣基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)集成測(cè)試策略將已見報(bào)道的 h-CLAT、DPRA 和 DEREK 數(shù)據(jù)整合成一個(gè)含 101 個(gè)化學(xué)品的數(shù)據(jù)集，并將各類試驗(yàn)數(shù)據(jù)折算成 0 ~ 2 分后進(jìn)行分?jǐn)?shù)加和[17]。如表 1 和表 2 所示，該方法與 LLNA 相比，對(duì)化學(xué)品致敏性和效力的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度分別達(dá)到 85% 和 71%[17]。Kimura 等[18]基于致敏性分類，將 IL-8 Luc 數(shù)據(jù)和 DPRA 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成 0 ~ 2 分，整合了一套基于分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)識(shí)別出了 23 個(gè) LLNA 法中強(qiáng)致敏劑中的 14 個(gè)并劃分為強(qiáng)致敏劑，另外也識(shí)別出了 54 個(gè) LLNA 法中弱或中等致敏劑中的 38 個(gè)并歸類為弱致敏劑。該系統(tǒng)準(zhǔn)確度達(dá) 70.9%（表 2）。

2/3 預(yù)測(cè)模型：Urbisch 等[22]將 DPRA、KeratinoSens 和 h-CLAT 的各單項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果整合成 2/3 預(yù)測(cè)模型：即任何兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果相同，則模型整體評(píng)價(jià)與該結(jié)果相同。以該預(yù)測(cè)模型對(duì) 213 種化學(xué)品進(jìn)行評(píng)估，與人試驗(yàn)數(shù)據(jù)相比準(zhǔn)確度高達(dá) 90%，與動(dòng)物 LLNA 數(shù)據(jù)相比，準(zhǔn)確度達(dá) 79%。

圖 1 分層測(cè)試策略

整合不同試驗(yàn)數(shù)據(jù)可有效克服單一試驗(yàn)的不足[23]。Strickland 等[24]通過對(duì) 120 個(gè)化學(xué)品 LLNA、DPRA、h-CLAT 和 KeratinoSens 數(shù)據(jù)的編制，并將可能影響物質(zhì)致敏的物理化學(xué)因素考慮在內(nèi)，構(gòu)建了一系列預(yù)測(cè)模型。其中 7 個(gè)模型準(zhǔn)確度較高，并將 3 個(gè) pre-半抗原和 6 個(gè) pre/pro-半抗原準(zhǔn)確識(shí)別為致敏物。此外，4 個(gè)表現(xiàn)最優(yōu)的模型在模型訓(xùn)練和測(cè)試中均準(zhǔn)確識(shí)別出 16 個(gè) pro-半抗原。

5 小結(jié)

直接肽反應(yīng)試驗(yàn)具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度和操作相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過研究者們不斷優(yōu)化和發(fā)展，已具備了一定的生物轉(zhuǎn)化能力，可用于對(duì) pre/pro-半抗原進(jìn)行致敏性評(píng)價(jià)，并降低了對(duì)待測(cè)物的濃度要求，從而進(jìn)一步拓展了其應(yīng)用范圍。然而各類致敏試驗(yàn)替代方法均有其內(nèi)在局限，目前均不能完全替代動(dòng)物試驗(yàn)，而各類替代方法的整合成為趨勢(shì)。直接肽反應(yīng)試驗(yàn)在各類整合替代試驗(yàn)方案中，不可或缺。我們相信隨著皮膚致敏體外試驗(yàn)方法的不斷完善和計(jì)算機(jī)致敏評(píng)估模型的持續(xù)優(yōu)化和升級(jí)，皮膚致敏試驗(yàn)替代方法的應(yīng)用將越來越廣。

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中國(guó)食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金課題（2017C6）

劉婷，Email：lutyliu@126.com

2018-09-12

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.014