陽 宏，楊晨熙

(武漢理工大學(xué)，材料復(fù)合新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

蛋白質(zhì)糖基化是生物界普遍存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[1]，在生理和病理過程中具有重要意義。糖基化修飾賦予了蛋白質(zhì)特定的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，使其在細(xì)胞粘附、細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝、細(xì)胞免疫等生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2-6]。而異常的蛋白質(zhì)糖基化被證實(shí)與惡性腫瘤、阿爾茨海默綜合癥等許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，臨床上常將其作為醫(yī)療診斷和治療的著手點(diǎn)[7-9]。因此，全面、準(zhǔn)確地研究蛋白質(zhì)糖基化具有重要的生物學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。

目前，基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)糖基化研究受到了廣泛關(guān)注[10]。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)糖基化已取得較大進(jìn)展，但如何實(shí)現(xiàn)糖肽的有效富集[11]，仍然需要深入研究。

常見的糖肽富集方法包括凝集素親和法、親水相互作用法、肼化學(xué)法、硼酸富集法等[12-13]。這些方法各有不足，如存在只能選擇性地富集樣品中特定的糖蛋白/糖肽[14]、操作繁瑣且樣品損失大[15]、富集效率不高等問題[16]。因此，開發(fā)一種性能優(yōu)異的糖蛋白/糖肽富集材料尤為重要。文獻(xiàn)[17]報道了利用表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(surface initiated atom transfer radical polymerization, SI-ATRP)合成一種脯氨酸(P)-天冬氨酸(D)二肽聚合物修飾的介孔二氧化硅(Pro-Asp homopolymer modified mesoporous silica gel, poly-PD@SiO2)材料，通過其表面豐富的親水基團(tuán)(—NH、—COOH等)與糖鏈—OH形成多重氫鍵相互作用，可實(shí)現(xiàn)對糖肽的有效富集。

本研究擬應(yīng)用高分辨和高質(zhì)量精度的組合型四極桿-靜電軌道阱(hybrid quadrupole Orbitrap, Q-Exactive Plus)質(zhì)譜儀，全面、深度地研究這種二肽聚合物修飾的介孔二氧化硅材料的糖肽富集效果，并與常用于糖肽富集的親水性相互作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)比較，希望為糖蛋白/糖肽的富集分離提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

組合型四極桿-靜電軌道阱質(zhì)譜儀(Hybrid Quadrupole Orbitrap, Q-Exactive plus)：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超低溫冰箱：海爾生物醫(yī)療公司產(chǎn)品；H1650-W微量臺式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；ZLS-1真空離心濃縮儀：湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；BWS-5恒溫水槽與水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Sep-Pak C18柱(1 mL/50 mg)：愛爾蘭Waters公司產(chǎn)品；HILIC小柱(3 mL/500 mg)：德國Macherey-Nagel公司產(chǎn)品；B-廣范試紙：上海三愛思試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

牛胎球蛋白(fetuin from fetal bovine serum)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、胰蛋白酶(trypsin from bovine pancreas,測序級)：均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；碘乙酰胺(IAA)：比利時Acros公司產(chǎn)品；碳酸氫銨：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；三氟乙酸(TFA)、乙酸、甲酸、乙腈、實(shí)驗(yàn)用水：均為色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1脯氨酸-天冬氨酸二肽聚合物修飾介孔二氧化硅的制備 按照文獻(xiàn)[17]合成脯氨酸-天冬氨酸二肽聚合物修飾介孔二氧化硅。首先，將丙烯酰氯中的酰氯與脯氨酸-天冬氨酸(Pro-Asp)中的氨基進(jìn)行取代反應(yīng)，制備丙烯酰化二肽功能單體(AAPD)；然后，利用2-溴異丁基酰溴將反應(yīng)引發(fā)基團(tuán)修飾到氨基硅球表面，得到酰溴化硅球；最后，將AAPD通過表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)(surface initiated atom transfer radical polymerization, SI-ATRP)接枝到酰溴化硅球表面，得到脯氨酸-天冬氨酸二肽聚合物表面修飾的介孔二氧化硅(poly-PD@SiO2)。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)干擾模型樣品的酶解 為評估新材料對糖肽的富集效果，將牛胎球蛋白(bovine fetuin)和牛血清蛋白(BSA，作為干擾蛋白)分別按照質(zhì)量濃度比為1∶1、1∶2、1∶5、1∶10和1∶100混合，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)干擾模型樣品。將適量的標(biāo)準(zhǔn)干擾模型樣品溶于50 mmol/L的pH8的NH4HCO3緩沖溶液，加入適量的250 mmol/L DTT水溶液，使其終濃度為5 mmol/L，在37 ℃水浴反應(yīng)45 min，使糖蛋白中的雙硫鍵斷裂。冷卻至室溫后，為防止二硫鍵的重新形成，加入適量的250 mmol/L IAA水溶液，使其終濃度為15 mmol/L，于黑暗處室溫靜置30 min，使其發(fā)生烷基化。隨后，向樣品中再次加入適量的250 mmol/L DTT水溶液樣品，至其終濃度為5 mmol/L，室溫靜置15 min，用以封閉過量的IAA。由于胰蛋白酶trypsin的最佳酶解條件為pH7.5～8.0、T=37 ℃，所以在注入胰蛋白酶前，需要利用50 mmol/L NH4HCO3緩沖溶液(pH8)調(diào)pH至8.0。最后，以胰蛋白酶/標(biāo)準(zhǔn)干擾模型樣品的質(zhì)量比為1∶50加入適量trypsin，于37 ℃水浴反應(yīng)過夜。待樣品酶解完成后，冷卻至室溫，加入適量10% TFA終止酶解反應(yīng)。

為除去酶解過程中引入的鹽類雜質(zhì)，需要利用C18反相柱對酶解混合物進(jìn)行脫鹽處理[18]。具體步驟為：1) 向C18反相柱中依次加入3 mL乙腈、1 mL乙腈-水-乙酸溶液(70∶30∶0.25,V/V/V)、1 mL乙腈-水-乙酸溶液(40∶60∶0.5,V/V/V)、1 mL乙腈-水-乙酸溶液(20∶80∶0.5,V/V/V)、3 mL含0.1%三氟乙酸的水溶液，以平衡C18柱；2) 將樣品注入C18除鹽柱中；3) 加入3 mL含0.1%三氟乙酸的水溶液，除去酶解產(chǎn)物中的鹽類；4) 先后注入1 mL乙腈-水-乙酸溶液(40∶60∶0.5,V/V/V)、1 mL乙腈-水-乙酸溶液(70∶30∶0.25,V/V/V)，將吸附的非糖肽/糖肽洗脫出來。最后，用真空離心濃縮儀干燥洗脫液。

1.3.3酶解后樣品中糖肽的分離富集 取1.00 mg poly-PD@SiO2材料于離心管中，加入500 μL乙腈-水-甲酸溶液(75∶24∶1,V/V/V)平衡材料。然后，取100 μg 1.3.2節(jié)濃縮干燥后的非糖肽/糖肽混合樣品，溶解于不同濃度的乙腈-水-0.1%甲酸溶液，再與色譜材料平衡液充分混合，振蕩孵育15 min。隨著樣品質(zhì)量的增大，相應(yīng)增加孵育平衡液的體積。離心除去上清液后，用100 μL乙腈-水-甲酸溶液(75∶24∶1,V/V/V)洗滌4次，用40 μL乙腈-水-甲酸溶液(73∶26∶1,V/V/V)洗滌3次，每次洗滌后離心除去上清液。最后用40 μL乙腈-水-甲酸溶液(40∶59∶1,V/V/V)洗脫2次，高速離心6 min，保留上清液，經(jīng)真空離心濃縮儀干燥后，于-80 ℃保存，待測。

參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行HILIC富集糖肽，并對其進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。具體方法如下：首先，用3 mL乙腈-水-三氟乙酸溶液(80∶20∶0.1,V/V/V)沖洗平衡HILIC小柱3次；然后，用小于100 μL乙腈-水-三氟乙酸溶液(50∶50∶0.5,V/V/V)完全溶解以上酶解混合物，并向HILIC小柱中加入3 mL乙腈-水-三氟乙酸溶液(80∶20∶0.1,V/V/V)，將非糖肽/糖肽溶液注入HILIC小柱中，再用3 mL乙腈-水-三氟乙酸溶液(80∶20∶0.1,V/V/V)淋洗2次，以除去酶解混合物中的非糖肽；最后，用3 mL 0.1%三氟乙酸水溶液將吸附的糖肽洗脫下來并收集；洗脫液干燥后，于-80 ℃保存，待測。

1.3.4Hybrid quadrupole Orbitrap質(zhì)譜檢測和分析 將富集所得的糖肽干燥樣品分別溶解于80 μL不同濃度的乙腈-水-甲酸溶液中，在Hybrid quadrupole Orbitrap質(zhì)譜儀正離子模式下直接進(jìn)樣，流速1 μL/min，噴霧電壓2.00 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z300～2 000，分辨率35 000，AGC target值2×105。

將raw data數(shù)據(jù)文件通過Thermo Xcalibur Qual Browser軟件篩選后，利用UniProt (http:∥www.uniprot.org/)、ProteinProspector(http:∥prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm) 對非糖肽序列信息進(jìn)行匹配， GlycoMod Tool (http:∥web.expasy.org/gly-comod/)對糖肽信號進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索[20]，最后借助單糖連接的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律、已有的文獻(xiàn)資料輔助人工篩選和GlycoWorkbench 2.1驗(yàn)證，確定糖肽結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 進(jìn)樣溶劑對質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響

不同進(jìn)樣溶劑對質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響示于圖1，可以看出，進(jìn)樣溶劑中加入0.1%甲酸后可以多檢測出20個糖肽信號，所以，甲酸的添加對糖肽的檢測有重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸-40%乙腈-水溶液作為質(zhì)譜檢測的進(jìn)樣溶劑。

2.2 檢測濃度的優(yōu)化

為探討從混合干擾模型樣品中富集得到的糖肽樣品的最佳檢測濃度，將富集所得的同一糖肽樣品分別稀釋為0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2、3、4、5 g/L。不同進(jìn)樣濃度下，糖肽離子總強(qiáng)度占所有檢測離子強(qiáng)度的比率示于圖2a。

圖1 40%乙腈水溶液(a)和0.1%甲酸-40%乙腈水溶液(b)作為進(jìn)樣溶劑對質(zhì)譜響應(yīng)的影響Fig.1 Influence of 40% acetonitrile aqueous solution (a) and 0.1% formic acid in 40% acetonitrile aqueous solution (b) as the solvent for MS detection

在進(jìn)樣濃度0.25 ～1 g/L范圍內(nèi)，糖肽離子總強(qiáng)度覆蓋率從22.5%升至56.15%，糖肽信號顯著提升；隨著進(jìn)樣濃度的進(jìn)一步增大，糖肽離子總強(qiáng)度覆蓋率在55%～60%范圍內(nèi)小幅波動，糖肽信號趨于穩(wěn)定。因此，檢測濃度大于1 g/L時，才能得到信號強(qiáng)度適宜的糖肽譜圖。為進(jìn)一步明確糖肽樣品的最佳檢測濃度，選取5個信號最強(qiáng)的糖肽進(jìn)行分析，其離子峰的信號強(qiáng)度示于圖2b，top1至top5分別對應(yīng)m/z1 633.9 583(4+)、1 307.3 653(5+)、1 534.6 332(3+)、1 089.6 423(6+)、1 183.2 487(4+)。隨著檢測濃度的增大，糖肽離子峰的信號強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)檢測濃度為1 g/L時，離子峰信號強(qiáng)度均達(dá)到5×106以上，且隨著濃度進(jìn)一步增大，信號強(qiáng)度均趨于平穩(wěn)。由此可知，牛胎球蛋白富集所得的牛胎球蛋白酶解糖肽樣品的最佳檢測濃度為1 g/L。

圖2 進(jìn)樣濃度與糖肽離子信號覆蓋率(a)和5個主離子峰最高信號強(qiáng)度(b)的相關(guān)曲線Fig.2 Plots of intensity coverage of all glycopeptides (a) and signal intensity of the five most abundant glycopeptides (b) vs. sampling concentration

2.3 poly-PD@SiO2糖肽富集條件的優(yōu)化

樣品富集前是否進(jìn)行脫鹽處理對poly-PD@SiO2的糖肽富集效果有顯著影響，結(jié)果示于圖3。通過對比圖3a、3b可以看出，樣品未脫鹽時，僅能檢測到17個糖肽信號，脫鹽后，所得糖肽信號增加至22個，且糖肽信號的強(qiáng)度得到加強(qiáng)。如RPTGEVYDIEIDTLETTCHVLDPTPLAN(99)CSVR+(Hex)6(HexNAc)5(NeuAc)3糖肽，未脫鹽時，測得m/z1 633.961 9(4+)的信號強(qiáng)度僅為1.58×106，脫鹽后該離子的信號強(qiáng)度為1.25×107，增強(qiáng)了近10倍。這是因?yàn)閜oly-PD@SiO2主要通過脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)二肽聚合物表面的多個氫鍵作用位點(diǎn)(—NH、—COOH)與糖肽的聚糖側(cè)鏈上的—OH發(fā)生氫鍵作用來實(shí)現(xiàn)對糖肽的富集。如果樣品中存在鹽離子，會破壞這種氫鍵的相互作用，不利于糖肽的吸附。因此，脫鹽處理對poly-PD@SiO2成功富集糖肽非常重要。

樣品經(jīng)酶解除鹽、干燥濃縮后，實(shí)驗(yàn)探討了對非糖肽/糖肽混合樣品再溶解時所用的乙腈水溶液(含0.1%甲酸)的濃度對poly-PD@SiO2富集糖肽效果的影響，結(jié)果示于圖4。當(dāng)溶液含有75%乙腈時，樣品只能部分溶解，譜圖中存在m/z707.338 9(3+)、1 006.195 1(3+)、1 260.161 0(2+)等多個非糖肽信號，且糖肽分子信號強(qiáng)度相對較低，糖肽的最高檢出信號強(qiáng)度為1.53×107；當(dāng)溶液含59%乙腈時，樣品完全溶解，譜圖中未出現(xiàn)明顯的非糖肽信號，且檢測到40個糖肽信號，最高檢出信號強(qiáng)度為2.51×107。雖然含40%乙腈溶劑和不含乙腈溶劑也都能夠完全溶解樣品，但檢出的最高糖肽信號強(qiáng)度普遍較低，分別為1.25×107和7.78×106，且檢出的糖肽信號個數(shù)明顯少于59%乙腈溶液，這可能由于溶劑極性過大，干擾了poly-PD@SiO2通過氫鍵作用吸附糖肽。因此，選擇59%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)為濃縮干燥后的非糖肽/糖肽混合樣品再溶解的最佳溶劑。

圖3 脫鹽前(a)、后(b)的糖肽富集情況Fig.3 Enrich efficiency of glycopeptides before (a) and after (b) desalting

2.4 poly-PD@SiO2富集糖肽的結(jié)構(gòu)解析

經(jīng)poly-PD@SiO2富集的糖肽質(zhì)譜圖和對應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)示于圖5?？梢姡矙z測出45個糖肽信號，包括文獻(xiàn)[21-23]報道中的牛胎球蛋白的3個N-糖基化位點(diǎn)和4個O-糖基化位點(diǎn)，其連接的糖鏈結(jié)構(gòu)包含文獻(xiàn)[21-23]報道中除(Hex)6(HexNAc)5(NeuAc)1以外的所有聚糖結(jié)構(gòu)。(Hex)6(HexNAc)5(NeuAc)1在牛胎球蛋白中的含量僅為2.2%[23]，可能是本實(shí)驗(yàn)未測到該糖鏈的原因。

2.5 poly-PD@SiO2和HILIC小柱對糖肽富集效果的比較

poly-PD@SiO2和HILIC小柱從牛胎球蛋白與牛血清蛋白(干擾蛋白)的質(zhì)量濃度比分別為1∶2、1∶5、1∶10的酶解樣品中富集糖肽的質(zhì)譜結(jié)果示于圖6。每個poly-PD@SiO2富集樣品中，均檢測到至少33條糖肽信號，包含牛胎球蛋白中除第341位O糖基化位點(diǎn)以外的所有糖基化位點(diǎn)，且檢測到的糖肽信號強(qiáng)度大部分在1×107左右；與之相比，HILIC小柱富集樣品檢出的糖肽信號較少，且隨著干擾蛋白濃度的增加，富集靈敏度顯著降低，檢測的糖肽信號強(qiáng)度均低于1×107。以上結(jié)果表明，與HILIC小柱相比，poly-PD@SiO2能夠從牛胎球蛋白與牛血清蛋白的酶解樣品中富集到更多糖基化修飾信息，表明該材料能夠高選擇性地富集唾液酸型糖肽，效果優(yōu)于目前常用的糖肽色譜分離材料。此外，當(dāng)樣品中牛血清蛋白濃度為牛胎球蛋白的100倍時，poly-PD@SiO2仍能成功富集糖肽，結(jié)果示于圖7。譜圖中檢測到32條糖肽信號，并且與樣品不含干擾蛋白時所包含的糖基化位點(diǎn)和糖鏈結(jié)構(gòu)信息相差不大。

注：a.75%；b.59%；c.40%；d.0%圖4 不同濃度乙腈的水溶液(含0.1%甲酸)對poly-PD@SiO2富集糖肽效果的影響Fig.4 Effects of concentration of acetonitrile on enrichment of glycopeptides by poly-PD@SiO2

圖5 Poly-PD@SiO2富集樣品的質(zhì)譜圖和對應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)Fig.5 Mass spectrum of sample enriched by poly-PD@SiO2 and corresponding structures of glycans

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用高分辨和高質(zhì)量精度Hybrid quadrupole Orbitrap (Q Exactive Plus)質(zhì)譜儀分析poly-PD@SiO2對糖肽樣品的富集能力。對其富集過程進(jìn)行優(yōu)化后，poly-PD@SiO2可從牛血清蛋白(干擾蛋白)濃度為牛胎球蛋白(糖蛋白)濃度100倍的樣品中成功富集糖肽，并檢測到32條糖肽信號，分別對應(yīng)除第341位O-糖基化位點(diǎn)以外的所有牛胎球蛋白糖基化位點(diǎn)及其所連接的糖鏈結(jié)構(gòu)。與常用的HILIC小柱相比，poly-PD@SiO2表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，有望成為一種高效的糖肽分離富集材料。

圖6 poly-PD@SiO2(a,b,c)和HILIC小柱(d,e,f)從牛胎球蛋白和牛血清蛋白濃度比分別為1∶2(a，d)、1∶5(b,e)、1∶10(c,f)的酶解樣品中富集糖肽的質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectra of glycopeptides enriched from samples containing fetuin and bovine serum albumin in ratio of 1∶2 (a, d), 1∶5 (b, e) and 1∶10 (c, f) by poly-PD@SiO2 (a, b, c)and HILIC (d, e, f)

圖7 poly-PD@SiO2從牛胎球蛋白和牛血清蛋白濃度比為1∶100的酶解樣品中富集糖肽樣品的質(zhì)譜圖Fig.7 MS spectrum of glycopeptides enriched from samples containing fetuin and bovine serum albumin in a ratio of 1∶100 by poly-PD@SiO2