劉 丹，李 亮，劉 彩，陳笑艷，鐘大放

(1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330006；2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所藥物代謝研究中心，上海 201203)

多黏菌素E(colistin)自1950年被發(fā)現(xiàn)后一直是多黏菌素類抗生素中重要的一種，但在20世紀(jì)70年代，由于其具有較高的腎毒性和神經(jīng)毒性而被撤市，隨后發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭氏陰性菌及泛耐藥引起的感染有較強(qiáng)的作用。近年來(lái)，隨著抗菌藥物、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，多藥耐藥菌迅速增加，老藥多黏菌素成為抗多藥耐藥菌的最后防線，引起了研究者的關(guān)注[1]。但有研究[2]發(fā)現(xiàn)，帶有MCR-1基因的細(xì)菌也表現(xiàn)出了對(duì)多黏菌素的耐藥性，這提示我們要更加關(guān)注對(duì)多黏菌素類抗生素的研究及使用。

目前市售的多黏菌素E主要有硫酸多黏菌素E和甲磺酸多黏菌素E兩種，且均為多黏菌素E1(Colistin A)和多黏菌素E2(Colistin B)的混合物[3]。有文獻(xiàn)[4]報(bào)道，多黏菌素E1和多黏菌素E2在抑菌活性上無(wú)明顯差別，但二者混合物比單一成分的活性低，主要是因?yàn)槎邥?huì)相互競(jìng)爭(zhēng)血漿蛋白結(jié)合位點(diǎn)，影響游離藥物濃度，進(jìn)而影響藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)多黏菌素E1對(duì)腎臟的毒性比多黏菌素E2嚴(yán)重[5]。基于此，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司研制開發(fā)了甲磺酸多黏菌素E(甲磺酸多黏菌素E1和甲磺酸多黏菌素E2混合物)中的單一成分甲磺酸多黏菌素E2，即用甲磺酸基團(tuán)取代多黏菌素E2的5個(gè)堿性氨基，二者結(jié)構(gòu)示于圖1。甲磺酸多黏菌素E2是多黏菌素E2的非活性前藥，幾乎不被胃腸道吸收，主要通過(guò)肌肉注射或靜脈注射給藥，進(jìn)入人體后能夠代謝為多黏菌素E2而發(fā)揮殺菌作用。

圖1 甲磺酸多黏菌素E2(a)和多黏菌素E2(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of colistin B methanesulfonate (a) and colistin B (b)

目前，對(duì)多黏菌素E和甲磺酸多黏菌素E的質(zhì)譜定量研究已有報(bào)道[6-10]，如，Mercier等[6]建立了HILIC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中的多黏菌素E1和多黏菌素E2及其前藥甲磺酸多黏菌素E1和多黏菌素E2；Zhao等[7]建立了UHPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿及尿液中的多黏菌素E及甲磺酸多黏菌素E等。但二者對(duì)于甲磺酸多黏菌素E均是間接定量，分別測(cè)得體內(nèi)代謝產(chǎn)生多黏菌素E的濃度和體內(nèi)代謝加體外水解產(chǎn)生多黏菌素E的總濃度，即可計(jì)算出體內(nèi)的甲磺酸多黏菌素E的濃度[11]。Ma等[12]在多黏菌素E的定量研究中選擇ESI+檢測(cè)模式，分析了多黏菌素E的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜片段，發(fā)現(xiàn)主要的斷裂方式是肽鍵斷裂。甲磺酸多黏菌素E作為多黏菌素E的前藥，研究其體內(nèi)代謝過(guò)程具有重要意義，但目前尚未見對(duì)前藥甲磺酸多黏菌素E進(jìn)行直接測(cè)定或者對(duì)其色譜保留和質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行研究的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)甲磺酸多黏菌素E2進(jìn)行質(zhì)譜ESI-模式下的裂解分析，以獲得豐富的碎片離子結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)分析推測(cè)甲磺酸多黏菌素E2的質(zhì)譜裂解規(guī)律，旨在為甲磺酸多黏菌素E2及其類似物的快速結(jié)構(gòu)解析、定量分析和藥動(dòng)學(xué)研究提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC系統(tǒng)：配備二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、脫氣機(jī)和TUV紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Triple TOF 5600+型四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧電離源和CDS自動(dòng)校正系統(tǒng))、PeakViewTM軟件：均為美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品。

甲磺酸多黏菌素E2鈉鹽原料藥(批號(hào)：160225115)：由正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供；乙腈(色譜純)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；氨水(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；超純水：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：5 mmol/L醋酸銨(含0.001%氨水)(A)-乙腈(B)；流速0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫：0～1 min(5%B)，1～7 min(5%～40%B)，7～9 min(40%～70%B)，9～11 min(70%～90%B)，11～12 min(90%B)，12～14 min(90%～5%B)，14～17 min(5%B)。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(ESI)，負(fù)離子掃描(高靈敏度模式)方式檢測(cè)；GAS1：55，GAS2：50，Curtain GAS：35；源溫度400 ℃；離子噴霧電壓(ISVF)-4 500 V；去簇電壓-80 V；一級(jí)全掃描時(shí)碰撞能量為-8 eV；產(chǎn)物離子掃描時(shí)碰撞能量分別為(-25±5) eV(二甲磺酸多黏菌素E2)、(-15±5) eV(三、四甲磺酸多黏菌素E2)、(-8±5) eV(五、六甲磺酸多黏菌素E2)；質(zhì)量掃描范圍m/z80～1 500；采用自動(dòng)校正系統(tǒng)(CDS)外標(biāo)法校正質(zhì)量數(shù)。

1.4 樣品溶液制備

取規(guī)格為150 mg(以多黏菌素E2計(jì))的注射用甲磺酸多黏菌素E2鈉鹽，加入一定體積純水定量轉(zhuǎn)移，得25 g/L的儲(chǔ)備液；用純水稀釋儲(chǔ)備液，配制成100 mg/L的工作溶液作為測(cè)試溶液。儲(chǔ)備液及工作溶液均于-20 ℃保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離

甲磺酸多黏菌素E2原料藥為混合物，含有不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)以及不同位置修飾的多黏菌素E2組分，各組分之間可通過(guò)極性不同或取代基位置不同得以分離。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水、乙腈-5 mmol/L醋酸銨水溶液、乙腈-5 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.001%氨水)、甲醇-5 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.001%氨水)體系作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)甲磺酸多黏菌素E2混合物的色譜分離行為和離子化響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，選取乙腈-5 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.001%氨水)為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰的峰形尖銳對(duì)稱，分離度及離子化效果均較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇該溶液作為流動(dòng)相。各組分的保留時(shí)間隨著甲磺酸取代基數(shù)目的減少(極性減弱)而增加，但具有相同甲磺酸取代基數(shù)目的位置異構(gòu)體較難實(shí)現(xiàn)完全分離。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的甲磺酸多黏菌素E2組分的色譜圖示于圖2，未檢測(cè)到單取代的甲磺酸多黏菌素E2(因此后文未對(duì)其分析)。

注：a.二甲磺酸多黏菌素E2；b.三甲磺酸多黏菌素E2；c.四甲磺酸多黏菌素E2；d.五甲磺酸多黏菌素E2；e.六甲磺酸多黏菌素E2圖2 不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)取代的多黏菌素E2的色譜圖Fig.2 Chromatograms of colistin B with different numbers of methanesulfonic acid groups

2.2 質(zhì)譜裂解

本實(shí)驗(yàn)選擇的電噴霧電離是一種軟電離技術(shù)，易于得到目標(biāo)物的相對(duì)分子質(zhì)量信息。通過(guò)ESI一級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子得到物質(zhì)的分子質(zhì)量信息，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)技術(shù)可以使準(zhǔn)分子離子發(fā)生碎裂，從而得到化合物的結(jié)構(gòu)信息[13]。

2.2.1一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析 采用電噴霧離子源，在負(fù)離子檢測(cè)方式下對(duì)5種不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)取代的多黏菌素E2進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，均能檢測(cè)到很強(qiáng)的雙電荷準(zhǔn)分子離子峰[M-2H]2-，六甲磺酸、五甲磺酸、四甲磺酸、三甲磺酸、二甲磺酸多黏菌素E2的[M-2H]2-分別為m/z858.291、811.296、764.312、717.327、670.344。這可能是因?yàn)榧谆撬岫囵ぞ谽2的分子質(zhì)量較大，較大的分子結(jié)構(gòu)有利于電子分散，在負(fù)離子模式下，化合物多個(gè)位點(diǎn)的電子親和勢(shì)較低，容易電離多個(gè)氫產(chǎn)生多電荷離子。

2.2.2二級(jí)質(zhì)譜分析 為了研究分子結(jié)構(gòu)與裂解途徑之間的關(guān)系，通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離對(duì)不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)取代的多黏菌素E2的[M-2H]2-準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，所得碎片離子信息列于表1，二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖3。

表1 甲磺酸多黏菌素E2組分的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Accurate mass data of colistin B with different numbers of methanesulfonic acid groups

六甲磺酸多黏菌素E2的準(zhǔn)分子離子[M-2H]2-為m/z858.291，通過(guò)CID解離分析，得到了m/z858.291 4、817.304 4、811.306 6、785.322 5、776.319 3、770.317 3、735.330 1、729.329 9、703.348 3、694.342 6、688.342 7、682.344 2一系列質(zhì)譜峰(圖3e)。其中m/z858.291 4與m/z817.304 4，m/z817.304 4與m/z776.319 3，m/z776.319 3與m/z735.330 1，m/z735.330 1與m/z694.342 6相比均相差40.985(±0.003)，考慮到碎片為雙電荷離子，即在結(jié)構(gòu)上相差81.970，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上的C—S鍵斷裂，中性丟失一分子H2SO3，此種斷裂方式文獻(xiàn)[14]中已有報(bào)道，主要是通過(guò)五元環(huán)過(guò)渡態(tài)發(fā)生重排反應(yīng)形成了亞胺結(jié)構(gòu)。相似的裂解方式也存在于含有磺酸基團(tuán)的結(jié)構(gòu)中，通過(guò)六元環(huán)過(guò)渡態(tài)發(fā)生重排反應(yīng)而斷裂[15]；此外，發(fā)現(xiàn)m/z858.291 4與m/z811.306 6，m/z817.304 4與m/z770.317 3，m/z776.319 3與m/z729.329 9，m/z735.330 1與m/z688.342 7，m/z729.329 9與m/z682.344 2相比均相差46.986(±0.001)，因?yàn)樗槠瑸殡p電荷離子，所以質(zhì)量相差93.972，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上亞甲基與相連的仲胺發(fā)生C—N鍵斷裂，中性丟失CH2SO3。該中性丟失可能是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其形成的原因可能是亞甲基碳原子連有2個(gè)吸電子基團(tuán)，帶有部分正電荷，容易被甲磺酸羥基進(jìn)攻而形成環(huán)氧結(jié)構(gòu)。這種斷裂方式與Bianco等[16]報(bào)道的硫代葡萄糖苷的斷裂方式類似。除以上兩種裂解方式外，還發(fā)現(xiàn)m/z817.304 4與m/z785.322 5，m/z735.330 1與m/z703.348 3相比相差31.980(±0.001)，因?yàn)樗槠瑸殡p電荷離子，所以質(zhì)量相差63.960，推測(cè)為磺酸基上羥基遷移造成中性丟失一分子SO2。Ben-Ari等[17]在2005年曾報(bào)道苯磺酸類結(jié)構(gòu)在CID中可以發(fā)生二氧化硫的丟失；2008年，Sun等[18]報(bào)道了芳基磺酸類結(jié)構(gòu)在負(fù)離子模式下可以通過(guò)重排發(fā)生二氧化硫的中性丟失。因此，甲磺酸多黏菌素E2中性丟失SO2可能也是通過(guò)這種重排消除的方式發(fā)生的，其裂解途徑示于圖4(斷裂過(guò)程圖只以分子離子的其中一種可能取代情況發(fā)生斷裂的過(guò)程示意，后文相同)。

注：a.二甲磺酸多黏菌素E2；b.三甲磺酸多黏菌素E2；c.四甲磺酸多黏菌素E2；d.五甲磺酸多黏菌素E2；e.六甲磺酸多黏菌素E2圖3 不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)取代的多黏菌素E2[M-2H]2-離子的ESI-MS2譜圖Fig.3 ESI-MS2 of [M-2H]2- ions of colistin B with different numbers of methanesulfonic acid groups

五甲磺酸多黏菌素E2的準(zhǔn)分子離子[M-2H]2-為m/z811.296，通過(guò)CID解離分析，得到了m/z811.295 6、770.313 2、764.313 1、729.331 5、723.331 4、688.344 7、682.351 2一系列碎片離子(圖3d)。其中m/z811.295 6與m/z770.313 2，m/z770.313 2與m/z729.331 5，m/z729.331 5與m/z688.344 7均相差40.985(±0.003)，如前所述，推測(cè)五甲磺酸多黏菌素E2是甲磺酸基團(tuán)上的C—S鍵斷裂，中性丟失H2SO3；m/z811.295 6與m/z764.313 1，m/z770.313 2與m/z723.331 4，m/z729.331 5與m/z682.351 2均相差46.986(±0.001)，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上亞甲基與相連的仲胺發(fā)生C—N鍵斷裂，中性丟失CH2SO3。

四甲磺酸多黏菌素E2的準(zhǔn)分子離子[M-2H]2-為m/z764.312，通過(guò)CID解離分析，得到了m/z764.312 3、732.331 8、723.325 0、717.326 1、691.344 5、685.343 1、682.338 1、676.339 2、670.334 8、635.353 2、629.352 0一系列碎片離子(圖3c)。其中m/z764.312 3與m/z723.325 0，m/z732.331 8與m/z691.344 5，m/z723.325 0與m/z682.338 1，m/z676.339 2與m/z635.353 2，m/z670.334 8與m/z629.352 0均相差40.985(±0.003)，如前所述，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上的C—S鍵斷裂，中性丟失H2SO3；m/z764.312 3與m/z717.326 1，m/z717.326 1與m/z670.334 8，m/z732.331 8與m/z685.343 1，m/z723.325 0與m/z676.339 2均相差46.986(±0.001)，與六甲磺酸多黏菌素E2類似，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上亞甲基與相連的仲胺發(fā)生C—N鍵斷裂，中性丟失CH2SO3；m/z764.312 3與m/z732.331 8相差31.980(±0.001)，推測(cè)為磺酸基上羥基遷移導(dǎo)致中性丟失一分子SO2，可能的裂解途徑示于圖5。

注：斷裂圖中質(zhì)荷比(m/z)數(shù)值為理論值，以下同圖4 六甲磺酸多黏菌素E2的[M-2H]2-離子可能的ESI-MS2斷裂方式Fig.4 Proposed fragmentation pathways of [M-2H]2- of colistin B with six methanesulfonic acid groups in ESI-MS2

三甲磺酸多黏菌素E2的準(zhǔn)分子離子[M-2H]2-為m/z717.327，通過(guò)CID解離產(chǎn)生的碎片離子相對(duì)較少，得到了m/z717.326 7、685.345 6、676.341 9、670.339 0碎片離子(圖3b)。其中m/z717.326 7與m/z676.341 9相差40.985(±0.003)，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上的C—S鍵斷裂，中性丟失H2SO3；m/z717.326 7與m/z670.339 0相差46.986(±0.001)，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上亞甲基與相連的仲胺發(fā)生C—N鍵斷裂，中性丟失CH2SO3；m/z717.326 7與m/z685.345 6相差31.980(±0.001)，推測(cè)為磺酸基上羥基遷移導(dǎo)致中性丟失一分子SO2。

二甲磺酸多黏菌素E2的準(zhǔn)分子離子[M-2H]2-為m/z670.344，通過(guò)CID解離分析，得到了m/z670.343 9、638.358 5、623.354 2、601.342 2、585.328 8、579.330 5等碎片離子(圖3a)。其中，m/z670.343 9與m/z623.354 2相差46.986(±0.001)，推測(cè)是甲磺酸基團(tuán)上亞甲基與相連的仲胺發(fā)生C—N鍵斷裂，中性丟失CH2SO3；m/z670.343 9與m/z638.358 5相差31.980(±0.001)，推測(cè)為磺酸基上羥基遷移導(dǎo)致中性丟失一分子SO2；m/z623.354 2與m/z601.342 2，m/z601.342 2與m/z579.330 5相差22.013(±0.001)，雙電荷情況下即分子質(zhì)量相差44.026，推測(cè)為羥基α位C—C鍵斷裂導(dǎo)致中性丟失一分子CH3CHO；甲磺酸多黏菌素E2含有2個(gè)蘇氨酸片段，在CID中也會(huì)發(fā)生中性丟失乙醛，其消除機(jī)理是通過(guò)形成六元環(huán)過(guò)渡態(tài)發(fā)生的，該機(jī)理在Wang等[19-20]文獻(xiàn)中已報(bào)道。m/z670.343 9與m/z585.328 8相差85.015，推測(cè)為準(zhǔn)分子離子[M-2H]2-中性丟失一分子H2SO3和二分子CH3CHO產(chǎn)生的碎片，可能的裂解途徑示于圖6。

圖6 二甲磺酸多黏菌素E2的[M-2H]2-離子可能的ESI-MS2斷裂方式Fig.6 Proposed fragmentation pathways of [M-2H]2- of colistin B with two methanesulfonic acid groups in ESI-MS2

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)取代的多黏菌素E2進(jìn)行了色譜分離以及質(zhì)譜分析，對(duì)前藥甲磺酸多黏菌素E2的色譜和質(zhì)譜行為進(jìn)行了研究。在ESI負(fù)離子模式下，不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)取代的多黏菌素E2的一級(jí)質(zhì)譜特征信號(hào)均為[M-2H]2-。通過(guò)分析其二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑，未發(fā)現(xiàn)酰胺鍵斷裂的方式，主要為中性丟失CH2SO3、H2SO3、SO2、CH3CHO，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的ESI+質(zhì)譜裂解明顯不同。幾種不同數(shù)目甲磺酸基團(tuán)取代的多黏菌素E2的質(zhì)譜裂解方式基本類似，但中性丟失的分子略有不同，這與甲磺酸基團(tuán)取代數(shù)目有關(guān)。當(dāng)甲磺酸基團(tuán)取代個(gè)數(shù)較多時(shí)，易發(fā)生C—S鍵和C—N鍵斷裂，以中性丟失H2SO3、CH2SO3和SO2為主；當(dāng)甲磺酸基團(tuán)取代個(gè)數(shù)較少時(shí)，可發(fā)生C—C鍵斷裂，出現(xiàn)中性丟失CH3CHO的情況，且以中性丟失SO2和CH3CHO為主。此實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步研究甲磺酸多黏菌素E2及結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律提供基礎(chǔ)，對(duì)甲磺酸多黏菌素E2的快速篩選鑒別、定量分析和藥動(dòng)學(xué)研究有參考價(jià)值。

致謝：感謝正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司為本研究提供的甲磺酸多黏菌素E2原料藥。