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1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院，廣西 南寧 530199

朝天罐為野牡丹科金錦香屬植物朝天罐OsbeckiaopiparaC.Y. Wu et C.Chen的根，主產(chǎn)于貴州、廣西、廣東、臺(tái)灣及長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)[1-2]，可用于治腰膝酸軟、咯血、痢疾、咽喉痛、小兒風(fēng)熱、久咳、咯血、胃痛、白帶、月經(jīng)不調(diào)、胎漏下血、痔瘡出血及癌癥等[3-5]，為廣西瑤族地區(qū)的常用藥材。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，朝天罐根水提物對(duì)小鼠耳廓腫脹、腹腔毛細(xì)血管通透性及棉球肉芽腫等急、慢性炎癥模型具有顯著的抑制作用，其抗炎作用機(jī)制與抑制炎癥組織中PGE2生成有關(guān)[6]。為了探討朝天罐的抗腫瘤活性，實(shí)驗(yàn)研究了朝天罐水提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞7721、人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2增殖率、集落形成率的影響，并用Hoechst33342熒光染色法檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用，旨在為藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞SMMG-7721、人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑 朝天罐(采于廣西金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)天然藥物與生藥學(xué)教研室焦愛軍教授鑒定為朝天罐根。按文獻(xiàn)方法[6]，取藥材1000 g，加10倍量水浸泡30 min，煮沸，維持1 h，紗布過濾，藥渣再加入5倍量水，煮沸，維持30 min，紗布過濾，合并濾液，濃縮至1000 mL，冷卻后，4 ℃冰箱放置備用。RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國(guó) Hyclone 公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；青霉素、鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Thermo Fisher公司)；CCK-8(上海尚寶生物科技有限公司)；Hoechst 33342(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Termo Forma公司)；酶標(biāo)儀(香港分子儀器公司)；熒光倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，所用培養(yǎng)基含有RPMI 1640培養(yǎng)基、10%(V/V) 胎牛血清與 1%(V/V)青霉素-鏈霉素，在 37℃、5%(V/V)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 朝天罐對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響

2.2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入50×103個(gè)細(xì)胞。 設(shè)空白組和不同濃度的給藥組，待細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的藥物。藥物作用24 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入CCK8 10 μL，在培養(yǎng)箱中孵育15 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。使用Graphpad 軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

細(xì)胞存活率(%)=OD試驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1- OD試驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%

2.2.2 單細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入300個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組和不同濃度的給藥組，待細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的藥物。藥物作用24 h后吸出培養(yǎng)基，同時(shí)加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后吸出培養(yǎng)基，用甲醇在-20 ℃條件下固定細(xì)胞30 min，加入結(jié)晶紫染色15 min， PBS清洗2次后，記錄每孔細(xì)胞團(tuán)(細(xì)胞數(shù)>50個(gè))的數(shù)目，計(jì)算集落形成抑制率。

抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組集落數(shù)/對(duì)照組集落數(shù))×100%

2.3 Hoechst 33342 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入30 ×105個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組和不同濃度的給藥組，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的藥物。藥物作用 24 h后吸出培養(yǎng)基，用PBS 清洗1次，每孔加入PBS(含 1 g/L Hoechst 33342)，在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育 10 min。用 PBS清洗2次，在激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm 的熒光顯微鏡下隨機(jī)拍照。

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 CCK-8法細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的CTG處理24 h后，SMMG-7721的OD值與對(duì)照組相比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在1.25 mg/mL的濃度以上呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性關(guān)系，2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL分別對(duì)應(yīng)的OD值為0.942±0.042、0.87±0.015、0.750±0.038、0.426±0.065。經(jīng)計(jì)算IC50值為13.915 mg/mL，見表1。CNE-2細(xì)胞的OD值相較于對(duì)照組也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在濃度大于1.25 mg/mL時(shí)，開始出現(xiàn)明顯的濃度依賴性關(guān)系，2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL分別對(duì)應(yīng)的OD值為0.767±0.022，0.691±0.022,0.643±0.031,0.518±0.029，計(jì)算IC50為19.896 mg/mL。見表2。

表1 朝天罐水提物對(duì)7721細(xì)胞增殖的影響 (x±s，n=6)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01。

表2 朝天罐水提物對(duì)CNE-2細(xì)胞增殖的影響 (x±s，n=6)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2 單細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在CTG處理24 h后撤除藥物繼續(xù)培養(yǎng)，依然能明顯的抑制SMMG-7721和CNE-2細(xì)胞克隆團(tuán)的形成，與對(duì)照組相比，呈劑量依賴性，其中SMMG-7721細(xì)胞在0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL的藥物濃度處理下分別對(duì)應(yīng)的抑制率為9.17%、17.16%、38.46%、58.28%，詳見表 3。CNE-2細(xì)胞在0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL的藥物濃度處理下分別對(duì)應(yīng)的抑制率為5.29%、28.14%、47.35%、62.75%，詳見表 4。

表3 朝天罐水提物對(duì)7721細(xì)胞集落形成影響 (x±s，n=3)

注：與空白對(duì)照組比較**P<0.01。

表4 朝天罐水提物對(duì)CNE-2細(xì)胞集落形成影響 (x±s，n=3)

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01。

3.3 朝天罐水提物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33342是一種可以穿過細(xì)胞膜與染色質(zhì)結(jié)合的藍(lán)色熒光染料。細(xì)胞染色后通過熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示正常未給藥組細(xì)胞內(nèi)熒光較弱，細(xì)胞核形態(tài)正常，CTG作用48 h后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨CTG濃度的提高而出現(xiàn)增強(qiáng)，并伴有細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)異常，核凝縮的現(xiàn)象，提示CTG對(duì)SSMG-7721和CNE-2細(xì)胞的DNA具有損傷作用。見圖1和圖2。

4 討論

研究采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CTG體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用，結(jié)果顯示，經(jīng)不同的藥物濃度CTG處理24 h后，人肝癌細(xì)胞SMMG-7721、人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的增殖活性均受到明顯抑制，且抑制作用與藥物濃度呈依賴關(guān)系。采用Hoechst33342染色法觀察CTG對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMMG-7721、CNE-2細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的細(xì)胞破碎，核凝縮現(xiàn)象，表明CTG提取物可引起DNA損傷，從而引起細(xì)胞凋亡。由此提示，CTG可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)CTG水提物體外抗腫瘤作用進(jìn)行了初步探討，其抗腫瘤作用的活性成分、具體作用機(jī)制及體內(nèi)抗腫瘤活性尚待進(jìn)一步研究。