李向茸，王興隴，2，李 倩，2，馬瑞仙，2，張海霞，李瓊毅，2，馬忠仁，馮若飛，*

(1．西北民族大學生物醫(yī)學研究中心，甘肅蘭州730030;2．西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030)

跨膜蛋白39A(Transmembrane protein 39A，TMEM39A)是一種多通道膜蛋白，與跨膜蛋白39B同屬于跨膜蛋白39家族，這2種亞型由可變剪接形成［1］?？缒さ鞍阻偳队诩毎啥?，它作為通道或裝運碼頭來支配相關分子在生物膜上的運輸或進入，也可將產生的副產品運出細胞［2］。Park 等［3］的研究表明，TMEM39A 的 mRNA含量在膠質瘤組織和細胞樣本中明顯上調，推測TMEM39A可能作為一種新的診斷標志物和治療靶點在神經膠質瘤和其他癌癥的治療中發(fā)揮作用。針對TMEM39A的深入研究可以為臨床治療某些自身免疫疾病、腫瘤和癌癥等提供新思路。目前，針對TMEM39A的檢測方法國內外均無相關報道，本研究建立了 TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法，為進一步研究TMEM39A的生物學功能及與其他蛋白的相互作用奠定了一定的基礎，同時在臨床上也為與TMEM39A相關的某些疾病的預防及治療提供了一種快速檢測和定量分析技術。

1 材料與方法

1．1 細胞、菌株及質粒

人皮膚鱗癌細胞(A431)、敘利亞倉鼠腎細胞(BHK-21)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)、大鼠腦膠質瘤細胞(C6)、小鼠成肌細胞(C2C12)、甘加羊腎細胞(GJY)、人胚腎細胞(HEK293)、人宮頸癌細胞(HeLa)、粉紋夜蛾卵巢細胞(Hi-5)、河曲馬睪丸細胞(HQM)、人肝癌細胞(HuH-7)、牛腎細胞(MDBK)、犬腎細胞(MDCK)、人胚肺成纖維細胞(MRC-5)、豬腎細胞(PK15)、草地夜蛾卵巢細胞(Sf9)、豬睪丸細胞(ST)、非洲綠猴腎細胞(Vero)均由甘肅省動物細胞工程技術研究中心提供;大腸埃希菌(Escherichia coli)BL21感受態(tài)細胞購自生工生物工程(上海)有限公司;pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;pMD18-T-TMEM39B、 pMD18-T-TMEM43 及pMD18-T-IFITM2克隆載體均由生物工程與技術國家民委重點實驗室提供。

1．2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自蘭州百靈生物技術有限公司;胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司;細胞總RNA提取試劑盒、M-MLV及質粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;Xho I內切酶、Not I內切酶及LA Taq聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;SYBRSelect Master Mix購自美國 ThermoFisher Scientific公司。

1．3 引物設計與合成

根據 GenBank中的 TMEM39A基因序列(BC021277.2)，利用 Primer Premier 5.0設計 1對擴增TMEM39A全長開放閱讀框(ORF)的常規(guī)PCR引物和1對熒光定量通用性引物，選取不同種屬TMEM39A基因的保守區(qū)域設計熒光定量引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

1．4 TMEM39A質粒標準品的制備

提取HEK293細胞總RNA，采用兩步法反轉錄合成cDNA。以此cDNA為模板，用常規(guī)PCR引物進行PCR，擴增全長TMEM39A基因片段。PCR反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，59℃60 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化PCR產物，將其克隆于pMD18-T載體上，構建重組克隆質粒pMD18-T-TMEM39A。進行酶切和測序鑒定，測定重組質粒的濃度，計算每μL質粒含有的拷貝數(shù)，將該質粒標準品命名為TMEM39A-Standard。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the primers

1．5 TMEM39A熒光定量 PCR方法的建立及優(yōu)化

采用SYBR GreenⅠ染料法，利用合成的熒光定量PCR通用性引物TMEM39A qF/R，在ABI熒光定量PCR儀上進行擴增和結果分析。以Ct值最小和熒光值最高及溶解曲線不出現(xiàn)非特異性擴增產物為標準，分別對引物濃度(5、10、15、20 μmol·L－1)、退火溫度(55、56、57、58、59、60、61、62℃)等條件進行優(yōu)化，建立TMEM39A基因的熒光定量PCR反應。

1．6 標準曲線的繪制

將TMEM39A-Standard進行10倍倍比稀釋，分別取 3.937 ×108、3.937 ×107、3.937 ×106、3.937 ×105、3.937 ×104、3.937 ×103拷貝·μL－16個濃度梯度的質粒作為模板，依照上述優(yōu)化的TMEM39A SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應條件進行擴增。以相應拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。待熒光定量PCR的反應結束后，繼續(xù)對反應產物進行加熱，溫度升高至95℃，反應15 s，接著溫度降低至65℃，反應1 min，DNA雙鏈復性，熒光分子綁定在DNA雙鏈上，所以熒光信號值到達最高點。從65℃緩慢升溫至95℃，持續(xù)記錄此時的熒光信號變化量，然后以溫度作為橫坐標，單位時間內熒光信號的變化量為縱坐標繪制溶解曲線。如果溶解峰是單一的，表示產物擴增特異;反之，則意味有非特異性擴增。

1．7 特異性試驗

分別以本實驗室構建的質粒濃度均為3.937×107拷貝·μL－1的其他3種跨膜蛋白陽性克隆載體 pMD18-T-TMEM39B、 pMD18-T-TMEM43、pMD18-T-IFITM2及TMEM39A-Standard為模板，采用上述反應體系和條件，分別進行熒光定量PCR，檢測該方法的特異性。

1．8 敏感性試驗

取3.937×108～3.937×101拷貝·μL－18個濃度梯度的TMEM39A-Standard分別作為模板，進行熒光定量PCR，以確定本方法的檢測下限。同時采用常規(guī)PCR方法進行檢測［12］，比較2種方法的敏感性。

1．9 重復性試驗

隨機選取3個濃度(3.937×107、3.937×106、3.937×103拷貝·μL－1)的 TMEM39A-Standard分別作為模板，進行熒光定量PCR。組內和組間試驗各做3次重復，評價本方法的重復性。

1．10 不同種屬細胞樣品檢測

分別提取人源、豬源、猴源、鼠源、犬源、羊源、馬源、牛源及昆蟲細胞等18種不同細胞的總RNA，反轉錄后利用上述建立并優(yōu)化的TMEM39A SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法進行檢測，分析試驗結果。

2 結果與分析

2．1 TMEM39A質粒標準品的制備與鑒定

TMEM39A基因擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1.5 kb處可見一條特異性條帶，大小與預期一致(圖1-A)。重組質粒pMD18-TTMEM39A經XhoⅠ、NotⅠ雙酶切后，出現(xiàn)2條清晰的條帶，約為2.6 kb和1.5 kb，與預期相符(圖1中B)。測序結果與BC021277.2參考序列進行比對，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.9%和99.8%，為特異性目的序列，表明TMEM39AStandard質粒標準品構建成功。測得該質粒濃度為650 ng·μL－1，根據拷貝數(shù)計算公式得出對應的拷貝數(shù)為3.937 ×1011拷貝·μL－1。

2．2 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

經條件優(yōu)化最終確定的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應體系為:SYBRSelect Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，TMEM39A qF/R(10 μmol·L－1)各 1.0 μL，模板 2.0 μL。反應條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40次循環(huán)。根據擴增曲線得出最佳的引物使用濃度為10 μmol·L－1，最佳退火溫度為 58 ℃。

2．3 標準曲線的繪制

圖1 TMEM39A基因PCR擴增(A)及重組質粒pMD18-T-TMEM39A的酶切鑒定(B)Fig．1 Identification of TMEM39A gene and its recombinant plasmid pMD18-T-TMEM39A

將TMEM39A-Standard進行倍比稀釋后，取6個濃度梯度進行熒光定量PCR。標準曲線方程Y= －3.564logX+45.706，相關系數(shù)(r)為0.999，在3.937×108～3.937×103之間Ct值與質粒濃度呈現(xiàn)良好的線性關系(圖2-A)，且擴增效率為90.813%，滿足要求(r＞0.99，110＞Eff% ＞90)，表明標準曲線建立成功。在溶解溫度為(80±1)℃處出現(xiàn)單一的特異性峰，無非特異性擴增及引物二聚體出現(xiàn)(圖2-B)。

2．4 特異性

分別以本課題組構建的 pMD18-TTMEM39B、pMD18-T-TMEM43、pMD18-T-IFITM2及TMEM39A-Standard為模板，采用本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法進行擴增，結果顯示，除TMEM39A-Standard能夠出現(xiàn)特異性擴增外，其他跨膜蛋白均不產生擴增。表明該方法特異性較好(圖3)。

2．5 靈敏度

分別以 3.937 ×108、3.937×107、3.937 ×106、3.937 × 105、3.937 × 104、3.937 × 103、3.937×102、3.937×101拷貝·μL－18個濃度梯度的TMEM39A-Standard作為模板，進行熒光定量PCR以及常規(guī)PCR擴增，比較2種方法的檢測下限。本方法能檢出的最低模板濃度為3.937×102拷貝·μL－1(圖4-A)，而普通PCR方法的檢測下限為3.937×104拷貝·μL－1(圖4-B)，表明本方法的敏感性較高，比常規(guī) PCR靈敏度高100倍左右。

2．6 重復性

圖2 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR標準曲線(A)和熔解曲線(B)Fig．2 The standard curve(A)and melting curve(B)of SYBR Green Ⅰ real-time PCR amplification for TMEM39A gene

圖3 引物TMEM39A qF/R的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR特異性Fig．3 Specificity of primers TMEM39A qF/R by SYBR GreenⅠreal-time PCR amplification

以3個濃度梯度的TMEM39A-Standard進行3次組內及3次組間重復測定，由統(tǒng)計分析結果可知，其組內變異系數(shù)為0.121% ～0.169%，組間變異系數(shù)為0.285% ～0.950%，均小于1.0%(表 2)，表明本研究建立的 TMEM39A SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

2．7 不同種屬細胞樣品檢測

以本研究建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量 PCR 方法對 HEK293、C6、ST、MDCK、MRC-5、HeLa、BHK-21、MDBK、SF9、HuH-7、Vero、CHOK1、GJY、Hi-5、A431、PK15、C2C12、HQM 細胞的cDNA進行檢測。結果顯示，不同種屬的細胞樣品中均能檢測到TMEM39A基因，但含量不同，HeLa細胞中的 TMEM39A含量最高，其次為HEK293細胞，HQM細胞中TMEM39A基因含量最少(圖5)，表明該方法可用于不同種屬樣品細胞中TMEM39A基因的檢測。

圖4 引物TMEM39A qF/R的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏性試驗Fig．4 Sensitivity detection of primers TMEM39A qF/R by using series plasmid dilutions with real-time PCR and PCR

3 討論

目前，有關TMEM39A基因的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)其在某些自身免疫疾病、腫瘤和癌癥的治療中發(fā)揮作用［4－11］，而且國內外針對 TMEM39A 的檢測方法尚處空白。基于此，快速、準確檢測TMEM39A在細胞或者組織中的含量變化對于某些自身免疫疾病、腫瘤和癌癥等的診斷及治療尤為重要。通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)，不同物種TMEM39A基因同源性為90% ～97%，針對不同物種TMEM39A基因的保守區(qū)域設計熒光定量引物，可以提高種屬通用性。

表2 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的組內、組間重復性實驗Table 2 Inter-assay and intra-assay reproducibility of SYBR GreenⅠreal-time PCR

圖5 不同種屬細胞的TMEM39A熒光定量PCR檢測Fig．5 Different species of cells detection by the established TMEM39A real-time PCR assay

本實驗成功建立了TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法。此方法經過條件優(yōu)化后，特異性較好，僅TMEM39A-Standard能夠出現(xiàn)特異性擴增，跨膜蛋白39B基因(TMEM39B)、跨膜蛋白43基因(TMEM43)及干擾素誘導的跨膜蛋白2基因(IFITM2)的陽性克隆載體均不產生擴增;靈敏性可達3.937×102拷貝·μL－1，是常規(guī) PCR方法靈敏度的100倍左右;組內和組間變異系數(shù)均小于1%，具有較高的重復性和穩(wěn)定性;可以檢測不同種屬來源細胞中的TMEM39A基因含量，具有種屬通用性。但不同種屬來源細胞中TMEM39A基因的表達水平不同，其中，腫瘤細胞(A431、HuH-7及 HeLa)中TMEM39A基因均呈高水平表達。有研究表明，TMEM39可能參與Parkin介導的線粒體自噬［12］，線粒體自噬和線粒體被認為是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要調控因子［13－15］。鑒于 TMEM39A 與腫瘤細胞的相關性，自噬可能成為TMEM39A進一步研究的方向［16］。該方法的建立為臨床提供了一種TMEM39A的快速檢測和定量分析技術，并為進一步研究TMEM39A功能奠定了基礎。