劉子明，金 晶，胡則輝，戴慶敏，李巧玲，施 倩，呂耀平，，*

(1．麗水學院生態(tài)學院，浙江 麗水323000;2．寧波大學 海洋學院，浙江 寧波315211;3．浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山316021;4．麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水323000)

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)，俗稱石蛙、石雞等，隸屬于兩棲綱、無尾目、蛙科、蛙屬，主要分布于我國浙江、江西、福建和湖南等省，因其肉質鮮美，具有較高的食用與藥用價值，是近幾年蛙類養(yǎng)殖的主要品種之一［1］。棘胸蛙人工養(yǎng)殖技術已經(jīng)成熟［2－3］，但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，疫病特別是細菌感染性疾病問題尤為突出［4］。已有報道表明，蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)［5］、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)［6］、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)［7］、腦膜炎敗血金黃桿菌(Chryseobacterium meningosepticum)［8］、奇異變形桿菌(Proteus vulgaris)［9］和布氏檸檬酸桿菌(Citrobacter braakii)［10］等會引發(fā)棘胸蛙疾病。白內障是棘胸蛙常見疫病之一，病蛙眼瞼灰白，食欲減退，易死亡，給生產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了極大的損失［10］。蛙白內障病可能存在多種致病菌，程曉云等［10］從患白內障病棘胸蛙中分離得到布氏檸檬酸桿菌，紀榮興等［11］、陳曉鳳等［12］從患病牛蛙中分離得到氣單胞菌(Aeromonas sp．)和醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)，周永燦等［13］從患病虎紋蛙(Rana tigrinarugulosa)中分離得到腦膜炎敗血黃桿菌(Flavobacteriu mmeningitidis)，廖冰潔等［14］從患病棘腹蛙(Paa boulengeri)中分離得到金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。棘胸蛙作為新興養(yǎng)殖蛙類，目前對其病害的研究較少。本研究從患白內障病棘胸蛙中分離篩選到病原菌，進行革蘭氏染色、生化和分子鑒定確定菌種，并通過人工回歸感染確定病原菌對棘胸蛙的致病性，并進行了組織病理觀察，最后對病原菌進行了藥敏試驗，旨在為棘胸蛙養(yǎng)殖與病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

患白內障病棘胸蛙和健康棘胸蛙由浙江省麗水市鼎鑫生物工程有限公司提供。病蛙5只，體質量為(175±25)g;健康成蛙200只，體質量為(150±16)g。

1．2 病原菌分離

取患白內障病棘胸蛙腹水觀察，排除寄生蟲和霉菌感染后，在無菌環(huán)境下取病蛙眼球、肝臟和腎臟等組織，無菌生理鹽水沖洗后，在無菌玻璃勻漿器中研磨，經(jīng)稀釋后涂布于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h后，挑取不同形態(tài)單個優(yōu)勢菌落分別接種于綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長及溶血情況，將具有溶血性的單菌落進一步在胰酪大豆胨瓊脂固體培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)。將分離純化得到的2個菌株分別命名為Mm1和Mm2，進行革蘭氏染色并觀察。

1．3 分離菌生理生化鑒定

將Mm1和Mm2菌株分別劃線于胰酪大豆胨瓊脂固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，隨后接種于細菌微量生化管，對其進行生化鑒定，主要包括糖發(fā)酵、醇發(fā)酵、乙酰甲基甲醇試驗、氧化酶和明膠水解等26項，根據(jù)反應結果參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行判定［15］。

1．4 16S rDNA 鑒定

將Mm1和Mm2菌株分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)24 h，2種菌分別取1 mL菌液，用天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以基因組DNA為PCR擴增模板，細菌16S rDNA通用引物(F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')擴增16S rDNA基因片段，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應體系:超純水9.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，模板 1 μL。PCR擴增程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55 ℃復性 30 s，72 ℃延伸 90 s，共 33 個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR擴增后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用AXYGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。所得產(chǎn)物連接至pGEM-T載體后轉化到大腸埃希菌感受態(tài)細胞Top10，陽性克隆送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1．5 人工回歸感染

分別挑取Mm1和Mm2單菌落到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24 h，得到濃度為7.1×108cfu·mL－1的細菌懸液，用無菌生理鹽水稀釋成菌液濃度為7.1×107、7.1×106、7.1×105、7.1 ×104cfu·mL－1的菌懸液。用制備的不同濃度菌懸液對健康棘胸蛙采用大腿肌肉注射方式進行感染，每只注射劑量為0.2 mL，同時設注射生理鹽水的對照組。每組健康棘胸蛙15只。

1．6 組織病理觀察

取人工回歸感染棘胸蛙和健康棘胸蛙的眼球、肝臟、腎臟和腸組織，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察并記錄。

1．7 抗生素敏感性檢測

采用藥敏紙片瓊脂平板擴散法對Mm1和Mm2進行藥敏試驗，選用妥布霉素、卡那霉素、頭孢他啶、鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素和慶大霉素7種藥敏紙片進行試驗，測定其抑菌圈直徑(平行重復3次)，直徑小于10 mm為不敏感或低度敏感，10～15 mm為中度敏感，大于15 mm為高度敏感。

2 結果與分析

2．1 剖檢變化

患病棘胸蛙眼球突出，眼瞼灰白，解剖后可見腹部有大量膿血水流出，肝臟膨大呈黑紫色，腎臟充血呈鮮紅色等癥狀(圖1)。

2．2 病原菌的分離與純化

病原菌在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上均呈β-溶血。革蘭氏染色鏡檢為陰性，呈短直桿狀(圖2)。

2．3 分離菌生理生化特性

分離菌生理生化特性見表1。由表可知，2種菌均能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，H2S陰性，MR試驗、觸酶、鳥氨酸、吲哚試驗和硝酸鹽還原試驗均為陽性，符合摩根菌屬特征。

2．4 分離菌16S rDNA基因測序與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖1 患病棘胸蛙臨床特征Fig．1 Clinical symptoms in infected Q．spinose

圖2 致病菌的革蘭氏染色Fig．2 Gram staining of pathogenic bacteria

以Mm1和Mm2 DNA為模板，擴增的16S rDNA基因條帶測序后，在GenBank進行BLAST分析，結果顯示分離菌與GenBank中摩氏摩根菌(Morganella morganii)的同源性最高，達97%。基于分離菌的16S rDNA基因序列及GenBank中摩氏摩根菌屬其他細菌的16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明，分離菌與摩氏摩根菌(Morganella morganii)聚為一支(圖3)。

2．5 人工回歸感染實驗

如表2所示，Mm1和Mm2分別以濃度7.1×104、7.1 ×105、7.1 ×106、7.1 ×107和 7.1 × 108cfu·mL－1感染健康棘胸蛙，感染3 d后，兩個感染組棘胸蛙均出現(xiàn)白內障病癥，表現(xiàn)為眼球凸出，眼瞼灰白，與自然發(fā)病個體癥狀基本相同(圖1)。用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算得到Mm1和Mm2兩個株菌對棘胸蛙的半數(shù)致死量(LD50)分別為3.92×106和4.95 ×106cfu·mL－1。

表1 菌株的生化指標Table 1 Biochemical indicators of the bacterial strains

2．6 眼球及主要臟器病理觀察

觀察人工感染摩氏摩根菌棘胸蛙的眼球病理組織切片(圖4)。比較健康蛙和患病蛙鞏膜，可見健康蛙和病蛙鞏膜上皮細胞均呈單層有序排列，細胞核排列規(guī)則，細胞間排列緊密，下層纖維排列整齊緊密。比較健康蛙和患病蛙晶狀體，可見健康蛙晶狀體外膜完整，內側排列整齊的立方狀上皮細胞，晶狀體基質呈分層排列，纖維排列規(guī)則，粗細一致;患病蛙晶狀體上皮細胞消解，無細胞結構，晶狀體基質排列結構紊亂，纖維多處斷裂、崩解、變性。

觀察人工感染摩氏摩根菌棘胸蛙的主要臟器病理組織切片，結果如圖5所示，與健康棘胸蛙腸、肝和腎相比，患病棘胸蛙腸組織腸壁壞死，且有包涵體出現(xiàn);肝組織嚴重壞死，肝細胞無具體形態(tài)，大面積核溶解;腎臟腎小管一側凝固性壞死。

2．7 抗生素敏感性試驗

Mm1和Mm2二種菌培養(yǎng)24 h后對其進行抗生素敏感性試驗，其抑菌圈直徑如表3所示。抑菌圈直徑小于10 mm為不敏感或低度敏感，10～15 mm為中度敏感，大于15 mm為高度敏感［16］，可見2種菌對氨芐西林和頭孢他啶均不敏感，對妥布霉素、四環(huán)素和卡那霉素表現(xiàn)出中度敏感。

此外，Mm1對鏈霉素高度敏感，Mm2對慶大霉素高度敏感。

圖3 Mm1和Mm2菌株根據(jù)16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig．3 Phylogenetic tree of Mm1 and Mm2 strain based on 16S rDNA gene sequence

表2 分離菌株對棘胸蛙的致病性(死亡數(shù)/試驗數(shù))Table 2 Pathogenic results of isolated bacteria strains on Q．spinose(deaths/number of test)

圖4 患病棘胸眼球病理組織學特征Fig．4 Pathological and histological features of eyeball in diseased Q．spinose

圖5 患病棘胸蛙內臟病理組織學特征Fig．5 Histological features of visceral pathology in diseased Q．spinose

3 討論

在水生生物中，引起眼球表面出現(xiàn)白內障的原因有寄生蟲性的和細菌性的。寄生蟲性的如復口吸蟲(Diplostomulum)的尾蚴和囊蚴等在養(yǎng)殖魚類過程中常常會引起魚類白內障?。?7］。但在蛙類中，引起蛙類白內障病的主要原因是細菌性感染，程曉云等［10］從患白內障病棘胸蛙中篩選得到病原菌布氏檸檬酸桿菌。如紀榮興等［11］和陳曉鳳等［12］分別從患白內障病牛蛙中篩選得到氣單胞菌和醋酸鈣不動桿菌。周永燦等［13］發(fā)現(xiàn)腦膜炎敗血黃桿菌會引起虎紋蛙白內障病。本試驗在排除寄生蟲感染后，從白內障病蛙中分離篩選得到2種病原菌，經(jīng)過生化鑒定，發(fā)現(xiàn)2種菌均能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，MR試驗、觸酶、鳥氨酸、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗均為陽性，符合《伯杰細菌鑒定手冊》描述的摩根菌屬(Morganella)特征。為進一步鑒定到種，PCR擴增了2種菌株的16S rDNA基因序列，BLAST分析確定2個菌株均與摩氏摩根菌16S rDNA具有較高的同源性。綜上所述，確定了病原菌為摩氏摩根菌。

表3 抗生素對菌株的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of antibiotics to bacterial strains

已知摩氏摩根菌屬于摩根菌屬，為革蘭氏陰性腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌，廣泛分布于水、土壤及人和動物糞便中［18］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌可感染多種養(yǎng)殖水生動物，在鱸魚(Lateolabrax japonicus)［19］、黃喉擬水龜(Mauremys mutica)［20］、大鯢(Andrias davidianus)［21］和胡子鯰(Clarias fuscus)［22］等中均有發(fā)現(xiàn)，成為了水生動物重要致病菌之一。而關于其對水生動物的致病機理鮮有相關文獻報道。本試驗對患白內障棘胸蛙進行了組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)病蛙眼球鞏膜正常并未發(fā)生病變，而晶狀體發(fā)生明顯的病變，主要表現(xiàn)為上皮細胞消解，基質排列結構紊亂，纖維多處斷裂、崩解、變性，這與哺乳動物白內障病病理觀察結果是一致的，白內障主要是晶狀體病變導致的［23－24］。另外，自然發(fā)病和人工感染的患白內障病棘胸蛙解剖后都可見肝臟膨大呈黑紫色，腎臟充血呈鮮紅色等癥狀，這與患白內障牛蛙的解剖觀察到的結果是一致的［11－12］。我們更進一步觀察了肝、腎和腸的病理組織切片，發(fā)現(xiàn)病蛙腸壁壞死，且有包涵體出現(xiàn);肝組織嚴重壞死，肝細胞無具體形態(tài)，大面積核溶解;腎臟腎小管一側凝固性壞死。由此可見，患白內障的棘胸蛙其病灶并不僅僅局限于眼部，其他內臟器官也不同程度受到感染且更加嚴重。多器官壞死、衰竭最終導致了病蛙的死亡。

抗生素藥物用于水生生物的病害防治一直都有較好的效果，但近幾年，由于抗生素藥物的濫用，細菌耐藥性現(xiàn)象屢見不鮮，且不同來源的同個菌種的抗藥性之間也存在差異。王磊等［25］發(fā)現(xiàn)黑格爾七彩神仙魚(Symphysodon discus)源摩氏摩根菌對青霉素G、頭孢氨芐、四環(huán)素、多西環(huán)素和呋喃唑酮等抗生素已產(chǎn)生耐藥性?？桌俚龋?6］進行中華鱉(Pelodiscus sinensis)源摩氏摩根菌藥敏試驗證實對四環(huán)素類、林可酰胺類、多肽類、喹諾酮類和磺胺類等耐藥。蘭云等［20］從黃喉擬水龜中分離篩選出的摩氏摩根菌對氨芐西林、頭孢噻吩、替考拉寧、復方新諾明和制菌霉素等14種抗生素耐藥，對慶大霉素、卡那霉素和諾氟沙星等7種抗生素敏感。本試驗研究發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌Mm1和Mm2均對氨芐西林和頭孢他啶產(chǎn)生了抗藥性，Mm1對鏈霉素高度敏感，Mm2對慶大霉素高度敏感。

本研究發(fā)現(xiàn)，摩氏摩根菌可感染棘胸蛙引起白內障病，并初步研究了病原菌的生物學特性、病理特征和藥物敏感性。魚類來源的摩氏摩根菌分子檢測技術已經(jīng)較成熟［27－28］，而兩棲類來源的摩氏摩根菌分子檢測技術還未見報道，接下來我們將對魚類來源摩氏摩根菌檢測技術應用到兩棲類的可能性進行試驗，或者開發(fā)兩棲類特異性的分子檢測技術，為預防摩氏摩根菌做好必要準備工作。