岑?；?，徐宗意，韓曉靜，常瓊瓊，段 琛，侯曉暉

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563000)

吸血蠓(Blood-sucking midges)是指能通過刺吸反芻動物血液來傳播蟲媒病原體的蠓蟲，包括庫蠓屬(Culicoides)、蠛蠓屬(Lasiohelea)、細蠓屬(Leptoconops)和澳蠓屬(Austroconops)的蠓蟲，共1 671種［1］，中國已知吸血蠓共3屬(不含澳蠓屬)443 種［2］。庫蠓屬(Culicoides Latreille，1809)是蠓科(Ceratopogonidae)中最大的一個屬，該屬蠓蟲體型微小、種類繁多、分布廣泛，可傳播藍舌病病毒(BTV)、家畜流行性出血熱病毒(EHDV)、施馬倫貝格病毒(SBV)、非洲馬瘟病毒(AHSV)等諸多病原體［3］，其中不顯庫蠓(C．obsoletus)和蘇格蘭庫蠓(C．scoticus)對BTV和SBV的傳播起到重要的媒介作用［4］。家畜流行病對畜牧業(yè)影響巨大，歐洲曾發(fā)生過藍舌病和施馬倫貝格病大流行［5－6］，我國雖然沒有發(fā)生大規(guī)模流行，但在云南、新疆、陜西、甘肅、山東和內(nèi)蒙古等29個省區(qū)的牛羊中可檢測出藍舌病病毒(BTV)［7］。由于吸血蠓與醫(yī)療衛(wèi)生和獸醫(yī)等領(lǐng)域關(guān)系密切，對蠓傳疾病進行監(jiān)控和防治就顯得尤為重要。因此，對吸血蠓進行快速準(zhǔn)確的分類鑒定，是監(jiān)控和防治吸血蠓的關(guān)鍵。

蠓類的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法以完整的成蟲(主要是雌蟲)為研究對象，但幼蟲階斷或肢體殘缺的蟲體難以辯認，并且蠓類中有效的形態(tài)鑒定特征極少，對近緣、近似種的分類鑒定十分困難。近年來，隨著研究人員對線粒體DNA的深度挖掘和廣泛應(yīng)用，線粒體DNA已成為昆蟲物種分類和分子系統(tǒng)發(fā)育分析的一種有效分子標(biāo)記［8－12］。本研究以庫蠓屬二囊亞屬中7個吸血蠓近似種為例，通過形態(tài)學(xué)特征和COⅠ基因序列，為更快速、準(zhǔn)確和客觀地鑒別不同生境下的吸血蠓近似種，并為后續(xù)的蠓蟲分類研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1.1 蠓蟲標(biāo)本

本研究中共有8種、16個地理種群、31只蠓蟲標(biāo)本，其中黑色庫蠓(C．pelius)、白帶庫蠓(C．a(chǎn)lbifascia)和荒川庫蠓(C．a(chǎn)rakawai)采自貴州、廣西、四川、重慶等省，無害庫蠓(C．innoxius)、不顯庫蠓(C．obsoletus)、東方庫蠓(C．orientalis)、蘇格蘭庫蠓(C．scoticus)和琉球庫蠓(C．a(chǎn)ctoni)的DNA數(shù)據(jù)來自于GenBank數(shù)據(jù)庫(表1)。

1．1.2 主要試劑及儀器

基因組提取試劑盒購自美國QIAGEN公司，PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest Agarose公司，PCR擴增儀、UVP凝膠成像系統(tǒng)購自美國BOI-RAD公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1．2 方法

1．2.1 蠓蟲采集

根據(jù)蠓蟲的生活習(xí)性，選擇網(wǎng)掃法和燈誘法在不同的生境布置采樣點采集蠓蟲，并將其保存于無水乙醇中，置于－20℃冰箱備用。

1．2.2 標(biāo)本鑒定

按照常規(guī)方法對蠓蟲標(biāo)本進行解剖、制片以及傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)鑒定，胸部樣本單獨編號后進行分子實驗。

1．2.3 基因組DNA提取

提取單只蠓蟲胸部組織基因組DNA，并保存至－20℃。

1．2.4 引物設(shè)計與PCR擴增

根據(jù)NCBI上已知序列設(shè)計引物，上游引物為LCO1490(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)，下 游 引 物 為 HCO2198(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)。PCR 擴增體系為:DNA 模板 1.5 μL，上下游引物各 1 μL，2 ×PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;最后72℃延伸5 min。

1．2.5 PCR產(chǎn)物鑒定與回收

PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶判斷是否為目的條帶。按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物切膠純化，純化后的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1．2.6 COⅠ基因序列分析

利用 Clustal X、DNA MAN、MEGA 6.0等生物信息學(xué)軟件對庫蠓線粒體DNA COⅠ基因序列進行比對、編輯、校正等序列分析，以Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離矩陣。以荒川庫蠓C．a(chǎn)rakawai為外群，通過鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并通過Bootstrap 1 000次自舉檢驗系統(tǒng)樹中各結(jié)點的置信值。

表2 供試吸血蠓的相關(guān)信息Table 1 Information of the biting midges

1．2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2．1 形態(tài)學(xué)特征

除了作為外群的帶紋亞屬荒川庫蠓(C．a(chǎn)rakawai的)形態(tài)特征易于鑒別外，其余7種二囊亞屬的吸血蠓近似種的形態(tài)特征十分相近(表2)。上述近似種頭部和腹部的5個形態(tài)特征基本一致，只有翅臀室淡斑數(shù)目、翅面淡、暗斑明顯程度等極細微的差異(圖1)。有些種類如不顯庫蠓(C．obsoletus)與蘇格蘭庫蠓(C．scoticus)、黑色庫蠓(C．pelius)與琉球庫蠓(C．a(chǎn)ctoni)的形態(tài)差異就更為稀少。

2．2 PCR擴增及序列測定和分析

本研究通過對蠓蟲線粒體COⅠ基因序列進行PCR擴增、純化和雙向測序，并經(jīng)過Clustal X序列比對及人工校對、編輯后，最終獲得長度為494 bp的COⅠ基因片段。應(yīng)用MEGA 6.0軟件對COⅠ基因序列進行分析，結(jié)果顯示序列無堿基插入和缺失位點，變異位點為206個，占41.7%。

2．3 COⅠ基因序列比對

圖1 吸血蠓近似種一側(cè)翅圖Fig．1 Wings of one side of sibling species

將黑色庫蠓(C．pelius)、白帶庫蠓(C．a(chǎn)lbifascia)和荒川庫蠓(C．a(chǎn)rakawai)的全部COⅠ基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的同源序列進行比對，與已有的荒川庫蠓(C．a(chǎn)rakawai)(登錄號分別為 KF528696、GU070920、AB360975)序列相似度皆大于99%，但是未搜索到另外2種庫蠓的COⅠ基因序列。

2．4 遺傳距離

利用MEGA 6.0軟件計算庫蠓COⅠ基因序列的遺傳距離，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，種內(nèi)和種間遺傳距離分別為0～0.014、0.114～0.332，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過庫蠓COⅠ基因的K-2P遺傳距離可以區(qū)分二囊亞屬的7種吸血蠓近似種，即適用于種及以下水平的種類鑒別。

表3 線粒體COⅠ基因序列遺傳距離Table 3 Genetic distances of mitochondrial COⅠgene sequences

2．5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以荒川庫蠓(C．a(chǎn)rakawai)為外群，采用鄰接法和最大似然法分別構(gòu)建7種庫蠓的系統(tǒng)發(fā)育樹，得到基本一致的拓撲結(jié)構(gòu)(圖2)。結(jié)果表明，8種吸血蠓各自構(gòu)成單系(群)，同一種類不同地理種群各自聚為一支，且同一生境下不同庫蠓種類間并無交叉。種類間的親緣關(guān)系明顯，不顯庫蠓(C．obsoletus)與蘇格蘭庫蠓(C．scoticus)、黑色庫蠓(C．pelius)與琉球庫蠓(C．a(chǎn)ctoni)首先各自構(gòu)成姐妹群，之后前者與白帶庫蠓(C．a(chǎn)lbifascia)聚為一支，而后者與東方庫蠓(C．orientalis)聚為一支，最后二者與無害庫蠓(C．innoxius)聚在一起構(gòu)成內(nèi)群，再與外群荒川庫蠓(C．a(chǎn)rakawai)匯合形成完整的有根樹。

3 結(jié)論與討論

圖2 基于線粒體COⅠ基因序列構(gòu)建的ML樹Fig．2 Maximum Likelihood tree constructed based on mitochondrial CO Ⅰ gene sequences

昆蟲的COⅠ基因作為編碼蛋白基因往往比核糖體基因(rRNA基因)擁有更多的變異位點，以利于近緣、近似種的鑒別。另外，作為編碼蛋白基因進行多序列比對時通常會更加容易，且堿基插入和缺失的幾率較核糖體基因小得多，這與序列比對及同源位點的識別密切相關(guān)［15］。本研究中，庫蠓COⅠ基因序列不存在插入和缺失位點，可作為蠓類分子鑒定首選的分子標(biāo)記。自從2003年Hebert等［14］倡導(dǎo)將COⅠ基因作為DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因開始，其已廣泛應(yīng)用于蠓類分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的研究［15－16］，可對95%的已知庫蠓進行準(zhǔn)確分類鑒定［13］。另外，COⅠ基因在很大程度上克服了受鑒定對象限制、時效性差和鑒定難度大等傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的缺陷［17］。本研究通過聯(lián)合形態(tài)學(xué)特征和COⅠ基因序列數(shù)據(jù)，進一步證實線粒體COⅠ基因序列在吸血蠓近似種的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究方面的適用性。

本研究中，吸血蠓近似種的種間遺傳距離遠遠大于種內(nèi)遺傳距離，且最大種內(nèi)遺傳距離不超過最小種間遺傳距離，說明COⅠ基因分子標(biāo)記足以區(qū)分不同物種，并且種內(nèi)個體變異程度較小，具有一定的保守性。綜合分析種間的平均遺傳距離(0.183)約是種內(nèi)(0.004)的46倍，符合Hebert等提出的種間差異大于種內(nèi)差異10倍的物種鑒定規(guī)則［18－19］。本研究中，重慶、廣西、貴州和四川等不同生境的荒川庫蠓(C．a(chǎn)rakawai)種內(nèi)遺傳距離不超過0.002，四川和重慶的白帶庫蠓(C．a(chǎn)lbifascia)的種內(nèi)遺傳距離為0.012，印度和中國海南的琉球庫蠓(C．a(chǎn)ctoni)的種內(nèi)遺傳距離為 0.014，均小于 2%，這與 Hebert等［18－19］提出的種內(nèi)遺傳距離不大于2%的結(jié)論相符。

本研究中，系統(tǒng)發(fā)育分析得到的NJ樹和ML樹拓撲結(jié)構(gòu)大體是一致的，但是亦有部分種類的種內(nèi)親緣關(guān)系等微小差異。分析原因，可能是由于不同建樹方法之間的理論基礎(chǔ)以及建樹的偏向性方面存在的差異，與史麗等［20］在對縞蠅亞屬的種團間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析情況類似。同時，形態(tài)學(xué)特征幾乎無異的不顯庫蠓(C．obsoletus)與蘇格蘭庫蠓(C．scoticus)、黑色庫蠓(C．pelius)與琉球庫蠓(C．a(chǎn)ctoni)在系統(tǒng)發(fā)育樹中各自優(yōu)先并為一支，構(gòu)成姐妹群，并且各分支均具有較高的置信值，這說明應(yīng)用線粒體COⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能有效區(qū)分近緣種且可靠程度較高。然而，在個別節(jié)點上亦存在置信值較低的情況，如黑色庫蠓(C．pelius)與琉球庫蠓(C．a(chǎn)ctoni)組成的姐妹群分支與東方庫蠓(C．orientalis)分支相結(jié)合的節(jié)點置信值僅為38，與李瑋瑋等［21］對小蔗螟的研究結(jié)果類似，可能是COⅠ基因的堿基組成及變異速度等方面存在差異，或者COⅠ基因序列片段提供的有效信息有限所致。本研究中，蠓類樣本僅為31只，且比對、編輯后的序列分析僅為494 bp，這在一定程度上會影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在蠓類的分子分類研究中，應(yīng)引入更為豐富的樣本數(shù)量和更為全面有效序列信息。

目前，由于核基因組中線粒體假基因的存在，會在一定程度上對庫蠓分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的準(zhǔn)確性造成干擾，其他類群已有研究系聯(lián)合mtDNA、rDNA及形態(tài)學(xué)特征對系統(tǒng)發(fā)育進行綜合分析，證實所得到的結(jié)果比單獨使用線粒體基因分析結(jié)果更為理想，如Carew等［22］通過聯(lián)合COⅠ和Cytb基因序列對搖蚊科昆蟲進行分類鑒定的成功率高達99%，Guo等［23］基于COⅠ和16S rDNA成功對麻蠅進行法醫(yī)鑒定。因此，在庫蠓的分類鑒定研究中，應(yīng)結(jié)合多種方法進行綜合分析，如聯(lián)合線粒體DNA分子標(biāo)記、傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類和幾何形態(tài)學(xué)分類綜合分析，以實現(xiàn)更為合理更為準(zhǔn)確的種類鑒定。同時，還可以通過分析線粒體DNA的變異位點、簡約信息位點和自裔位點以及計算其全體位點和各位點的轉(zhuǎn)換、顛換值來進一步探究庫蠓存在的變異和進化問題。