王 露，朱世揚，趙春田，裘娟萍

(浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州310014)

黃霉素，又稱黃磷脂醇、默諾霉素、班堡霉 素，是一種磷酸糖脂類抗生素，是目前唯一已知的能直接抑制肽聚糖糖基轉移酶的抗生素［1］。黃霉素具有促進動物生長、在動物體內和農畜產品中無殘留、對環(huán)境無污染、不易產生耐藥性等優(yōu)點。2001年，原農業(yè)部頒布的《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中允許黃霉素預混劑作為飼料藥物添加劑使用。黃霉素殺菌作用較強，不與其他常用抗生素產生交叉抗性，能夠抑制動物腸道中革蘭氏陽性病原菌。2002年，原農業(yè)部正式批準黃霉素預混劑為新獸藥［2］。加納鏈霉菌是黃霉素的主要生產菌。近年來，對黃霉素的研究主要集中在通過分子遺傳學或者化學方法改造加納鏈霉菌結構、改良其藥代動力學特性方面［3］，為黃霉素的應用奠定了基礎。

在利用分子生物學技術進行加納鏈霉菌基因改造的過程中，建立高效穩(wěn)定的遺傳操作系統(tǒng)是關鍵，但國內外有關加納鏈霉菌遺傳操作系統(tǒng)方面的研究鮮見報道。目前，接合轉移是大腸埃希菌與鏈霉菌之間最常用的基因轉移技術。本文研究接合轉移培養(yǎng)基、孢子預萌發(fā)條件、接合體系中供體菌與受體菌的濃度比，以及抗生素添加時間，選擇最適條件，建立并優(yōu)化大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移體系，為深入開展該菌的分子遺傳操作、提高該菌產生黃霉素的能力奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1.1 菌株和質粒

加納鏈霉菌(Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672、大腸埃希菌(Escherichia coli)DH5α、E．coli ET12567(pUZ8002)均由本實驗室保藏。質粒pMD-19購自TaKaRa公司。質粒pIJ8630由浙江大學李永泉教授惠贈。質粒pIJ8630-nsdA在pIJ8630的基礎上構建。

1．1.2 酶和試劑

安普霉素(Apr)、硫鏈絲菌素(Tsr)、鏈霉素(Str)、卡那霉素(Km)、氯霉素(Cm)、氨芐西林(Amp)、萘啶酸(NA)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司;rTaq、XbaⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標準物均購自TaKaRa公司;FastAP購自Thermo公司。

1．1.3 培養(yǎng)基

大腸埃希菌培養(yǎng)基為2×YT［4］;加納鏈霉菌液體培養(yǎng)基為TSB，固體培養(yǎng)基為YMS、2CMY、MM、AS-1、MS、改良高氏一號(簡稱 RG)和 TSB固體，配方參見文獻［5－6］。接合轉移培養(yǎng)基WL50(g·L－1):可溶性淀粉 5，氯化鈉 2.5，硫酸鎂3.6，氯化鎂4.8，酵母浸出粉1，丙氨酸0.2，精氨酸0.2，天冬酰胺0.5，瓊脂20，pH值7.5(滅菌前)，115℃滅菌30 min。

1．2 方法

1．2.1 基本遺傳操作

加納鏈霉菌ATCC 14672的培養(yǎng)方法參見文獻［7］。大腸埃希菌培養(yǎng)方法、感受態(tài)的制備及DNA轉化方法參照《分子克隆實驗指南》［4］。加納鏈霉菌總DNA的提取方法和接合轉移頻率的計算方法參照《鏈霉菌遺傳操作手冊》［5］。

1．2.2 重組質粒pIJ8630-nsdA構建

以加納鏈霉菌ATCC 14672基因組為模板，采用特異性引物nsdA-F:5’-GGGCTCTAGAGTGAGCGGCAACGGCGG-3’ 和 nsdA-R: 5’-CCAATCTAGATGGCATGGGGGAGCCGAG-3’(下劃線為XbaⅠ酶切位點)，PCR擴增長度1 590 bp的nsdA基因。進行TA克隆，轉化E．coli DH5α，經測序驗證后提取質粒，XbaⅠ酶切回收nsdA基因片段。經XbaⅠ單酶切、去磷酸化后的pIJ8630線性質粒用T4 DNA連接酶與nsdA基因片段連接，轉化E．coli DH5α，PCR驗證Apr抗性平板上的陽性克隆。轉化子送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。檢測引物序列為:CK-F，5’-CGACTCGGCTCCCCCATGCC-3’;CK-R， 5’-AACGCCAGCAAC GCGGCC-3’。

1．2.3 重組質粒 pIJ8630-nsdA轉化 E．coli ET12567(pUZ8002)

將重組質粒 pIJ8630-nsdA轉化到 E．coli ET12567(pUZ8002)感受態(tài)細胞中，利用 Apr、Cm、Km抗性平板篩選抗性菌落，再以特異性引物PCR進行轉化子的驗證。轉化子檢測引物序列同1.2.2節(jié)。

1．2.4 E．coli ET12567(pUZ8002，pIJ8630-nsdA)與加納鏈霉菌ATCC 14672的接合轉移

挑取 E．coli ET12567(pUZ8002、pIJ8630-nsdA)新鮮單菌落，接種于5 mL 2×YT液體培養(yǎng)基( 含 50 μg·mL－1Apr、25 μg·mL－1Cm、25 μg·mL－1Km)中，37 ℃、200 r·min－1培養(yǎng)過夜，按 1∶100的比例轉接到含相同抗生素的50 mL 2×YT液體培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)至對數生長期收集菌體，洗滌2次后懸浮備用。

在加納鏈霉菌平板上加入適量2×YT液體培養(yǎng)基，制備孢子懸液，振蕩充分打散孢子，過濾，孢子懸浮液濃度控制在108cfu·mL－1。50℃熱激10 min，37℃振蕩預培養(yǎng)3 h，備用。取500 μL備用的E．coli ET12567菌懸液與500 μL加納鏈霉菌孢子濾液混合，4 000 r·min－1離心 5 min，棄去大部分上清，用殘留液懸浮菌體后涂布于含10 mmol·L－1MgCl2的接合轉移平板，于 30 ℃培養(yǎng)14 h 后用抗生素水溶液(含 50 μg·mL－1Apr、500 μg·mL－1NA)洗去大腸埃希菌，然后取 1 mL抗生素水溶液覆蓋平板，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d長出接合子。用接合子數/初始孢子數表示接合轉移頻率［5］。

1．2.5 接合子的PCR驗證

取適量接合子菌絲體到含有50 μg·mL－1Apr的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集菌絲體，提取鏈霉菌總DNA為模板。根據質粒pIJ8630-nsdA上的Apr抗性基因aac(3)IV來設計引物，驗證陽性接合子。PCR反應程序:95℃ 5 min;95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，30個循環(huán);72℃ 延伸 10 min。引物序列:Apr-F，5’-TCTTCGCATCCCGCCTCTGG-3’;Apr-R，5’-GCAATACGAATGGCGAAAAG-3’。

2 結果與分析

2．1 供體菌構建

nsdA基因保守存在于多種鏈霉菌中，對鏈霉菌產孢、形態(tài)分化，以及抗生素合成均有負調控作用［8］。為研究接合轉移條件，構建nsdA基因過表達質粒 pIJ8630-nsdA，其圖譜見圖 1。pIJ8630-nsdA的酶切鑒定結果如圖2所示，泳道1表明該質粒經Xba I單酶切，得到7.9 kb大小的空載片段與1 590 bp的nsdA基因全長條帶，與預期相符。將pIJ8630-nsdA轉化到E．coli ET12567(pUZ8002)中，并利用特異性引物CK-F、CK-R進行PCR驗證。將驗證正確的轉化子E．coli ET12567(pUZ8002，pIJ8630-nsdA)作為接合轉移的供體菌。

2．2 受體菌產孢培養(yǎng)基選擇

在以鏈霉菌孢子為受體的接合轉移中，孢子的數量直接決定著接合頻率。將濃度約為108cfu·mL－1的加納鏈霉菌孢子液等量分別均勻地涂布在 YMS、2CMY、AS-1、MS、RG、TSB 和 MM 培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d。加納鏈霉菌在 YMS、2CMY、AS-1這3種培養(yǎng)基上菌苔厚實且孢子致密，其中，在2CMY培養(yǎng)基上孢子量最大;在MM培養(yǎng)基上菌苔稀薄;在MS、RG、TSB培養(yǎng)基上菌體生長速度快、菌苔厚實，但產孢量少。綜上，選定2CMY培養(yǎng)基用于加納鏈霉菌產生孢子。

2．3 接合子篩選標記選擇

圖1 質粒pIJ8630-nsdA圖譜Fig．1 Map of plasmid pIJ8630-nsdA

圖2 重組質粒pIJ8630-nsdA的酶切鑒定Fig．2 Restriction endonuclease identification of recombination plasmid pIJ8630-nsdA

為選擇大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移系統(tǒng)的抗性標記、確定合適的抗生素篩選濃度，考查加納鏈霉菌對4種在鏈霉菌接合轉移中常用抗生素的敏感性。結果表明，該菌對安普霉素、硫鏈絲菌素、鏈霉素均非常敏感，當濃度為12.5 μg·mL－1時即可完全抑制菌體生長，而卡那霉素則需在25 μg·mL－1的濃度下才能抑制加納鏈霉菌的生長。確定以安普霉素基因aac(3)IV為篩選標記。

2．4 大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移條件的單因素優(yōu)化

2．4.1 加納鏈霉菌接合轉移培養(yǎng)基

一種適合接合轉移的培養(yǎng)基應該同時滿足大腸埃希菌和鏈霉菌生長，并且使兩者生長速度均衡又有利于觀察接合子。本研究以加納鏈霉菌孢子為受體菌、E．coli ET12567為供體菌，依據加納鏈霉菌在不同培養(yǎng)基上的生長速度，同時參考其他鏈霉菌的最適接合培養(yǎng)基，選擇2CMY、MS、AS-1、RG、TSB的固體培養(yǎng)基進行接合轉移效果比較。結果顯示，在AS-1、MS、TSB固體培養(yǎng)基上接合子生長良好，且速度快，其中，AS-1接合平板的接合頻率最高(圖3)，所以選擇AS-1為大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移培養(yǎng)基。

Mg2+是眾多蛋白酶的輔因子，參與酶活性中心的形成。Choi等［9］研究表明，增加 Mg2+濃度能顯著提高接合轉移頻率。AS-1培養(yǎng)基中含有83 mmol·L－1MgSO4。試驗表明，在 30 ～150 mmol·L－1范圍內 MgSO4濃度的改變對接合轉移頻率沒有顯著影響。Mg2+除了來源于MgSO4，還來源于MgCl2。在標準的鏈霉菌接合轉移方法中，MgCl2以 10 mmol·L－1的濃度加入接合轉移培養(yǎng)基。本試驗將AS-1培養(yǎng)基中MgSO4濃度調整為30 mmol·L－1后，再向其中添加不同濃度的MgCl2(0、10、20、40、50 mmol·L－1)作為接合培養(yǎng)基。結果(圖4)表明，接合轉移頻率隨著MgCl2濃度的提高而提高。將接合轉移頻率最高的培養(yǎng)基配方命名為WL50。

圖3 不同基礎培養(yǎng)基對接合轉移頻率的影響Fig．3 Effect of different basal media on conjugation frequency

2．4.2 加納鏈霉菌孢子預萌發(fā)條件

熱激處理的目的是為了促進孢子萌發(fā)。過高的溫度會使孢子存活率降低，過低的溫度又起不到促進孢子萌發(fā)的作用。常規(guī)的鏈霉菌接合轉移過程中的熱激條件為50℃、10 min。為了確定加納鏈霉菌孢子萌發(fā)的最適熱激溫度和處理時間，設定40、45、50、55 ℃共4 個溫度，每個溫度選擇5、10、15、20 min 4 個時間梯度進行接合試驗。結果(圖5)表明，50℃、5 min為最佳的加納鏈霉菌孢子熱激條件。

圖4 接合轉移培養(yǎng)基中MgCl2濃度對接合轉移頻率的影響Fig．4 Effect of MgCl2concentration in conjugational transfer media on conjugation frequency

圖5 不同孢子熱激條件對接合轉移頻率的影響Fig．5 Effect of different spore heat treatment on conjugation frequency

熱激后的預培養(yǎng)處理有助于提高孢子的萌發(fā)頻率，從而提高接合頻率;但預培養(yǎng)時間過長會造成芽管萌發(fā)過長，受體聚集成團，出現多核細胞，難以獲得單菌落，造成接合轉移假陽性率增高。為了研究不同預培養(yǎng)時間對接合轉移的影響，將孢子50℃熱激10 min后，進行37℃預培養(yǎng)，以0.5 h為間隔取樣鏡檢。從圖6可以看出，預培養(yǎng)1.5 h時，由于孢子萌發(fā)，部分孢子體積開始膨大，細胞內氧化還原酶系開始活躍，美蘭著色變淺，菌體呈空心圓形。隨著預培養(yǎng)時間延長，體積變大的孢子數占比增大。3.0 h以后，大部分孢子美蘭不著色，呈現空心狀。到3.5 h時，有少量菌絲出現，孢子容易被菌絲纏繞而聚集。

取不同時間預培養(yǎng)的孢子為受體進行接合轉移，結果(圖7)顯示，在孢子預培養(yǎng)1.5～3.5 h期間，接合轉移頻率差別并不大，預培養(yǎng)3.0 h頻率相對較高。

2．4.3 接合轉移體系中供體菌和受體菌的比例

不同鏈霉菌的生理特性不同，因此，在接合轉移過程中所需的最適供體菌與受體菌比例存在差異。為了探索大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移體系的最佳供受體比例，限定受體菌的數量為108，將供體菌與受體菌細胞數分別以1∶100、1∶10、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1的比例混合，進行接合轉移試驗。依據圖8的結果，選定10∶1作為最佳的供受體比例。

2．4.4 接合轉移過程中安普霉素的添加時間

由于鏈霉菌在接合轉移培養(yǎng)基上生長速度存在差異，因此，抗生素添加時間對接合轉移頻率及接合子的有效檢出就會產生影響。對加納鏈霉菌接合轉移過程中安普霉素添加時間進行研究，結果(圖9)顯示，涂板后培養(yǎng)14 h時添加安普霉素效果最佳。

2．5 大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移條件的多因素優(yōu)化

圖6 不同預培養(yǎng)時間下孢子形態(tài)觀察Fig．6 Spore morphology at different pre-incubation times

圖7 孢子預培養(yǎng)時間對接合轉移頻率的影響Fig．7 Effect of pore pre-incubation time on conjugation frequency

圖8 供受比對接合轉移頻率的影響Fig．8 Effect of ratio of donor to recipient on conjugation frequency

圖9 安普霉素添加時間對接合轉移頻率的影響Fig．9 Effect of apramycin addition time on conjugation frequency

基于單因素試驗結果，選取對大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移頻率有較大影響的因素(A，MgCl2濃度;B，熱激時間;C，供受比)，進行大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合轉移試驗，每因素分別設置 3 個水平:A1，30 mmol·L－1，A2，50 mmol·L－1，A3，80 mmol·L－1;B1，5 min，B2，10 min，B3，15 min;C1，5∶1，C2，10∶1，C3，15∶1。從正交試驗結果(表1)看出，各因素對接合轉移頻率的影響為供受比＞MgCl2濃度＞熱激時間。理論最優(yōu)水平組合為A2B3C3，實際最優(yōu)水平組合為A2B2C3。

對正交試驗結果進行檢驗，結果表明，實際最優(yōu)組合A2B2C3與理論最優(yōu)組合A2B3C3的接合轉移頻率相近，與未優(yōu)化接合轉移條件相比，接合頻率提高了20.3倍。

2．6 接合轉移轉化子驗證

以E．coli ET12567為供體，加納鏈霉菌孢子為受體，進行接合轉移試驗。質粒pIJ8630-nsdA含有安普霉素抗性基因aac(3)IV和attP位點，屬于整合型質粒，可以整合到鏈霉菌基因組attB位點上，并隨基因組的復制而復制。經安普霉素平板篩選得到抗性菌落，分離純化后，隨機挑選9株接合子，分別提取其總DNA，使用特異性引物Apr-F、Apr-R擴增 aac(3)IV內部744 bp序列。接合轉移轉化子的PCR驗證結果如圖10所示，以pIJ8630-nsdA質粒DNA(陽性對照)和9株接合子DNA為模板，均能擴增出預期片段(744 bp)，而以出發(fā)株加納鏈霉菌 ATCC 14672總DNA為模板(陰性對照)則沒有條帶，說明質粒pIJ8630-nsdA成功接合轉移進入加納鏈霉菌。

3 討論

本文通過對接合轉移過程中的關鍵因素進行優(yōu)化，建立了一套較高效的大腸埃希菌-加納鏈霉菌ATCC 14672接合轉移方法，接合頻率提高95.3%。研究發(fā)現:1)由于接合轉移過程中需要DNA轉移酶、細胞壁水解酶等多種蛋白酶作用，因此，鎂離子可能參與這些酶活性中心的形成［10］。在鏈霉菌常用培養(yǎng)基中，只有AS-1培養(yǎng)基中含有大量鎂離子，所以AS-1培養(yǎng)基上接合頻率明顯較高。2)接合轉移頻率隨供受比增大而提高。這是因為隨著供體菌濃度增加，單位數量的鏈霉菌所接觸到的供體數量增加，進行接合轉移的幾率增高，故接合轉移頻率增高。供受比為15∶1時頻率最高，在今后的試驗中，可嘗試提高供受比。3)當熱激溫度低于50℃時，達不到多數加納鏈霉菌孢子萌發(fā)的條件，而高于50℃，會對孢子造成不定程度的損傷。隨著熱激時間延長，孢子活力降低，接合頻率隨之降低。4)由于群體中各個孢子萌發(fā)有先后，在3.5 h內每個時間段具接合轉移最佳狀態(tài)的孢子所占比例相差不大，所以預培養(yǎng)時間對接合頻率影響不大。5)接合14 h左右，大腸埃希菌中質粒向加納鏈霉菌轉移過程基本完成，此時接合頻率最高。小于14 h覆蓋抗生素，阻斷了部分菌體間的接合，導致接合頻率降低;而超過14 h后，由于生長速度的極大差異，過量的大腸埃希菌會產生菌膜覆蓋在鏈霉菌表面，與其爭奪氧氣與營養(yǎng)，導致鏈霉菌生長受到抑制，接合轉移率下降。

表1 正交試驗結果與數據分析Table 1 Results and data analysis of orthogonal test

圖10 S．ghanaensis(pIJ8630-nsdA)接合轉移轉化子PCR產物電泳檢測圖Fig．10 Electrophoresis analysis of PCR products of S．ghanaensis(pIJ8630-nsdA)exconjugants

加納鏈霉菌接合轉移體系的建立及優(yōu)化是對其進行分子遺傳操作、構建黃霉素高產菌株，以及驗證一些調控基因和次級代謝產物合成基因功能的必要前提。本研究為獲得更優(yōu)的大腸埃希菌-加納鏈霉菌接合條件提供了參考，同時為實現基因工程菌株的構建，以提高該菌產生黃霉素的能力奠定了基礎。