臧彧偉，王全禾，楊 龍，李 偉

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025)

鐵離子是細(xì)菌生長的重要營養(yǎng)元素，但過量鐵會引起細(xì)胞毒性［1］。保持鐵離子的儲存與代謝平衡對細(xì)菌至關(guān)重要［2］。細(xì)菌可能會通過鐵蛋白或鐵蛋白樣分子儲存胞質(zhì)中過量的鐵來達(dá)到平衡鐵離子利用與減少細(xì)胞毒性的目的［3］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中共存著兩種鐵儲存蛋白，一種為可結(jié)合血紅素的Bfr型鐵蛋白，另一種為不能結(jié)合血紅素的Ftn型鐵蛋白［4］。Ftn通常是一個由24個亞基組裝的球形蛋白，其中央為一個可大量儲存三價鐵的空腔［5］。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得鐵離子一直保持著可溶性狀態(tài)并阻止其參與氧化還原反應(yīng)從而造成活性氧脅迫［6］。Bfr型的鐵蛋白也是一個24亞基的球形結(jié)構(gòu)，不過其每兩個亞基可以結(jié)合一個血紅素分子，并且每個亞基中心都具有一個鐵氧化酶中心［7］。球形結(jié)構(gòu)中這些鐵氧化酶中心高度對稱［8］。研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌主要的儲鐵蛋白是Bfr，F(xiàn)tn只能收集極少量的鐵。尤其是在綠膿桿菌生長受到鐵離子極限缺乏條件時，從Bfr中獲得鐵離子是維持生長的主要途徑［2］。綠膿桿菌的Ftn型鐵蛋白中鐵離子釋放需要鐵氧還蛋白NADP還原酶(Fpr)提供電子;而Bfr鐵蛋白不僅需要Fpr提供電子而且需要脫鐵狀態(tài)的Bfr相關(guān)鐵氧還蛋白(apo-Bfd)協(xié)同作用才能實現(xiàn)鐵離子的釋放［2，9］。相反地，F(xiàn)tn是大腸埃希菌的主要鐵儲存蛋白，其Bfr蛋白的功能尚不清楚［10］。盡管植物、動物和微生物的Ftn型和Bfr型菌鐵蛋白亞基折疊方式和四級結(jié)構(gòu)都很類似，它們的序列相似性卻很低，這就極大地影響了其電荷交換的能力并造成了功能的巨大差異［3，11］。因此，開展不同生物鐵蛋白基因分離和功能鑒定對于深入了解這些基因在鐵離子代謝中的作用非常必要。黃鱔腸道假單胞桿菌是筆者實驗室分離到的一種非致病微生物。該菌分類地位上與Pseudomonas sp．TKP菌株非常相似，具有產(chǎn)表面活性劑的能力［12］。對于該菌鐵蛋白Bfr基因克隆及功能的研究國內(nèi)外尚沒有相關(guān)報道。因此，筆者擬通過克隆其Bfr基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行重組蛋白的分離純化及鑒定;分析重組蛋白鐵離子結(jié)合能力并探討其對該菌營養(yǎng)生長的影響，以期為深入了解假單胞桿菌Bfr基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1.1 質(zhì)粒和菌株

原核表達(dá)載體pGEX-4T-1購買自Amersham Bioscience公司;大腸埃希菌感受態(tài)DH5α、BL21(DE3)、pEASY-T1載體等購自北京全式金公司;黃鱔腸道假單胞桿菌菌株由長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所鑒定并保存。

1．1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自Thermo Scientific公司;質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、DNA聚合酶等購自北京全式金公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自 Invitrogen公司;GST-resin純化柱購自上海七海生物;DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物科技公司;硝酸纖維素膜購自武漢谷歌生物，菲洛嗪購自上海生工。

1．2 方法

1．2.1 Bfr基因的克隆及序列分析

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已知假單胞桿菌屬Bfr基因的序列設(shè)計一對基因特異性引物Bfr-F1(5’-ATGAAAGGCGACATCTCA-3’) 和 Bfr-R1(5’-TTATTCACCCATCTGCG-3’)，以黃鱔腸道假單胞桿菌gDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化后克隆至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，選取陽性菌落進(jìn)行序列測定。

測序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性分析。用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對并分析其相似性和限制性酶切位點(diǎn)信息。

1．2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)測序所得Bfr基因序列設(shè)計一對特異性表達(dá)引物rc-F(5’-TTAGAATTCATGAAAGGCGACATCTCAG-3’)和 rc-R(5’-GAACTCGAGTTATTCACCCATCTGCG-3’)，以黃鱔腸道假單胞桿菌基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上、下游引物分別增加了 EcoRⅠ和 XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后并用膠回收試劑盒回收純化。將純化產(chǎn)物及pGEX-4T-1載體用EcoRⅠ內(nèi)切酶和XhoⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，電泳、回收純化后加入T4 DNA連接酶于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR及雙酶切驗證后送往濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司測序。

1．2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Westernblot檢測

將測序正確的pGEX-4T-1-Bfr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，涂布在含有氨芐青霉素(50 μg·mL－1)的 LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆接種于含氨芐青霉素(50 μg·mL－1)的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r·min－1振蕩培養(yǎng)菌液 D600至 0.5 ～ 0.6，加入IPTG(125 μg·mL－1)繼續(xù)于 37 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)3 h，取40 μL菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況。

將陽性菌株按照體積比1∶1 000接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。于4 ℃、10 000 r·min－1離心 10 min 收集菌體，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸，冰上超聲裂解細(xì)菌，超聲5 s，間隔10 s，總時間15 min，4 ℃，10 000 r·min－1離心 10 min，取上清，用0.45 μm濾膜過濾后將上清加到GST-resin純化柱中，用還原型谷胱甘肽(6 mmol·L－1)洗脫，獲得GST-Bfr融合蛋白。

將純化的融合蛋白重新加到GST-resin純化柱中，用含有凝血酶(終濃度為3 U·mL－1)的Tris-HCl緩沖液酶切過夜，然后用Tris-HCl緩沖液洗脫Bfr蛋白，利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測Bfr蛋白酶切純化情況。

將純化得到的 GST-Bfr蛋白和Bfr蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，再用Tris緩沖液-吐溫(TBST)洗膜3次，每次10 min。隨即加入小鼠抗GST-tag單克隆抗體(1∶5 000)，37℃孵育2 h，用TBST洗膜6次，每次5 min。最后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶10 000)于37℃孵育2 h，用DAB顯色試劑盒顯色。

1．2.4 重組蛋白鐵離子螯合能力分析

在兩支含 150 μL 濃度為 1 mmol·L－1的FeCl3(或FeCl2)試管中分別加入160 μL的GSTBfr融合蛋白(113 μg·mL－1)或 Bfr蛋白(113 μg·mL－1)，補(bǔ)充Tris-HCl緩沖液至3 mL后于25℃、100 r·min－1振蕩孵育 60 min，隨即加入 120 μL的1%抗壞血酸，于室溫孵育20 min，再加入120 μL 的菲洛嗪(5 mmol·L－1)室溫孵育 10 min，最后用紫外分光光度計測定混合液在562 nm處的吸光值。以加入160 μL Tris-HCl緩沖液替代重組蛋白的作為空白對照，實驗重復(fù)3次。

1．2.5 重組蛋白對假單胞桿菌生長的影響

挑取假單胞桿菌單克隆于液體LB培養(yǎng)基中30 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng) 16 h。取 400 μL 培養(yǎng)液于40 mL新鮮 LB培養(yǎng)基中，加入2 mL FeCl3(1 mmol·L－1)和 100 μL Bfr蛋白(113 μg·mL－1)，于30 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h;搖動培養(yǎng)3 h后每間隔1 h取樣一次，重復(fù)3次，用紫外分光光度計測定各時間點(diǎn)樣品在600 nm處吸光值表征其生物量。以既不添加FeCl3也不添加Bfr蛋白的為陰性對照，以只添加FeCl3不添加Bfr蛋白的為陽性對照，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2．1 黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr基因的獲得及序列分析

利用引物對Bfr-F1/R1從黃鱔腸道假單胞桿菌gDNA中擴(kuò)增獲得了一條長約450 bp的條帶。將該P(yáng)CR產(chǎn)物測序后發(fā)現(xiàn)該基因全長471 bp，編碼一個長155 aa的多肽鏈(圖1)。

圖1 黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr基因的核苷酸序列及推斷的氨基酸序列Fig．1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Bfr from Pseudomonas spp．

將測序所得的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對，發(fā)現(xiàn)該基因與其他不同微生物來源的鐵蛋白基因具有較高的同源性。同時利用DNAMAN軟件進(jìn)行的多序列比對結(jié)果顯示:該基因推斷的氨基酸序列與來源于熒光假單胞桿菌的Bfr蛋白具有83.3%的同源性，而與耶爾森氏菌、雙歧桿菌、莢膜紅細(xì)菌、淋球菌、綠膿假單胞桿菌和沃爾巴克氏體來源的Ftn蛋白分別具有 49.4%、43.7%、40.2%、37.6%、45.9%和31.6%的同源性(圖2)，證明實驗已成功克隆得到黃鱔腸道假單胞桿菌的Bfr基因。

2．2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)純化及鑒定

用基因特異性引物對rc-F/R從假單胞桿菌gDNA中擴(kuò)增獲得的片段，雙酶切后與用同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的pGEX-4T-1連接，經(jīng)測序驗證的pGEX-4T-1-Bfr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，挑取陽性菌株用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，相對于誘導(dǎo)前和轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒的菌株，誘導(dǎo)后產(chǎn)生了一條分子量約為50 ku的條帶，符合預(yù)期大小(圖3-A)。

通過GST-resin純化柱結(jié)合帶有GST標(biāo)簽的蛋白，用還原型谷胱甘肽洗脫GST-Bfr蛋白，將洗脫的蛋白重新上柱后，再用凝血酶進(jìn)行酶切，經(jīng)Tris-HCl緩沖液洗脫獲得了Bfr蛋白，SDS-PAGE電泳檢測顯示純化后基本無雜蛋白，酶切后得到的Bfr蛋白大小約24 ku，比用軟件預(yù)測的略大，可能是凝血酶酶切后多余的氨基酸導(dǎo)致。

將SDS-PAGE凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別用小鼠抗GST-tag單克隆抗體為一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠二抗進(jìn)行Western blot免疫印跡的結(jié)果顯示，帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白被特異性識別，而酶切后的Bfr蛋白不能與抗體特異性識別，說明已成功實現(xiàn)了融合蛋白GST-Bfr和重組蛋白Bfr的純化(圖3-B)。

2．3 GST-Bfr蛋白和重組 Bfr蛋白與 Fe3+和Fe2+的螯合能力檢測

利用鐵螯合試劑菲洛嗪，筆者采用比色法檢測了融合蛋白GST-Bfr蛋白和重組Bfr蛋白與Fe3+和Fe2+的螯合能力。結(jié)果顯示，GST-Bfr蛋白在加入Fe3+和Fe2+后D562吸光值與對照均無明顯差別;而Bfr蛋白在加入Fe3+后D562吸光值顯著變小，加入Fe2+后D562吸光值與對照無顯著差異。證明融合蛋白GST-Bfr既不能螯合Fe3+也不能結(jié)合Fe2+;而Bfr蛋白可以螯合Fe3+，但不能螯合Fe2+。

2．4 重組蛋白對假單胞桿菌生長的影響

在外源添加Fe3+情況下通過測定假單胞桿菌在不同培養(yǎng)時間后的生物量，分析重組蛋白有無對假單胞桿菌營養(yǎng)生長的影響。結(jié)果表明:相對于陰性對照和陽性對照，只有當(dāng)Fe3+和Bfr蛋白同時存在時，才會促進(jìn)假單胞桿菌的生長。這一定程度上說明Bfr蛋白對假單胞桿菌獲得鐵營養(yǎng)元素具有重要作用。

圖2 Bfr推斷的氨基酸與其他微生物鐵蛋白序列比對結(jié)果Fig．2 Multiple alignment of ferritins from other species

圖3 融合蛋白的SDS-PAGE檢測(A)與Western-blot分析(B)Fig．3 Expression(A)and detection of the recombinant proteins(B)

圖4 Bfr蛋白與FeCl3、FeCl2的螯合能力分析Fig．4 Iron chelation detection of Bfr proteins

3 討論

圖5 不同培養(yǎng)時間假單胞桿菌的D600值Fig．5 D600values of Pseudomonas spp．a(chǎn)t different time point

細(xì)菌鐵蛋白Bfr是鐵蛋白家族中的一員，同時也是一種重要的儲存鐵和解毒蛋白［13－14］。細(xì)菌鐵儲存蛋白是由24個亞基和12個血紅素分子組成的球形蛋白，可以通過鐵結(jié)合位點(diǎn)將Fe2+氧化［15］，隨后 Fe3+被移到中央內(nèi)腔儲存起來［16］。因此，鐵蛋白可以在鐵過量的條件下起一定的作用［6，17］。目前已對綠膿假單胞桿菌［2，7］和大腸埃希菌的［10］鐵蛋白基因研究得比較透徹，而對其他假單胞桿菌的鐵蛋白基因的功能不甚清楚。本研究成功克隆了黃鱔腸道假單胞桿菌的Bfr基因，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因同目前已報道的Bfr類型的鐵蛋白基因同源性較高，而同F(xiàn)tn型鐵蛋白同源性較低，是一個新的Bfr型鐵蛋白家族的成員。在此基礎(chǔ)上，筆者構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并實現(xiàn)了融合蛋白的表達(dá);通過親和層析獲得了較純的Bfr蛋白。鐵離子螯合實驗發(fā)現(xiàn)Bfr蛋白可以結(jié)合Fe3+離子但不能螯合Fe2+，這說明黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr蛋白可能是一種重要的儲鐵蛋白。在外源添加Fe3+和Bfr蛋白時，能夠一定程度上促進(jìn)假單胞桿菌的生長，這可能是因為多余的Bfr蛋白結(jié)合Fe3+離子后起到了解毒效果并使得Bfr蛋白與細(xì)菌內(nèi)的鐵氧還蛋白相互作用形成復(fù)合物有利于保持細(xì)胞質(zhì)鐵穩(wěn)態(tài)所致［18］。該研究為進(jìn)一步分析不同微生物鐵蛋白的功能提供了基礎(chǔ)資料，應(yīng)深入研究該類型細(xì)菌鐵蛋白與黃鱔體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用獲鐵及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。