王儲炎，程俊文，祝 超

(1．合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601;2．浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州310023;3．浙江省森林食品研究重點實驗室，浙江杭州310023)

黑芝(Fructificatio amaurodermatis Rudae)屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬高等真菌，分布于福建、廣東、湖南、浙江、廣西、云南、西藏等地野外林中地上和地下的腐木上［1－2］。黑芝表面紫黑色至近黑色或紫褐色，菌蓋呈近圓形、半圓形或近小馬蹄形，菌柄側(cè)生或背側(cè)生，形狀為圓柱形或近念珠狀，直徑大小不一、粗細(xì)不等［3－5］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》上把黑芝列為上品，認(rèn)為黑芝“味咸平，主耳聾，利關(guān)節(jié)，益腎氣，通九竅，聰察，久食輕身不老延年仙”。中醫(yī)認(rèn)為，黑芝具有滋補強壯、扶正固本、延年益壽、增強免疫力等功效。江西黑芝含有人體所需要的微量元素鐵、鋅、銅、錳等，而且能夠清除DPPH自由基，具有較強抗氧化活性，其抗氧化能力強于赤芝［6－10］。

目前，關(guān)于黑芝的研究主要集中在發(fā)酵工藝方面，廖偉等［5］開展了黑芝菌菌絲體液體培養(yǎng)基的優(yōu)化研究，唐興國等［2］選用了果糖、蔗糖和乳糖作為碳源，探討了黑芝菌絲體發(fā)酵中不同水平的無機鹽與碳源之間的交互作用，葉明等［11］研究了黑芝多糖的提取工藝條件，廖婷婷等［12］研究了不同發(fā)酵時間、pH值和基礎(chǔ)培養(yǎng)基對黑芝菌絲體液態(tài)發(fā)酵的影響。利用黑芝菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的發(fā)酵工藝研究尚未有報道。本研究以野生黑芝菌作為供試菌種，通過液體發(fā)酵技術(shù)來生產(chǎn)胞外多糖，采用響應(yīng)面法來優(yōu)化其發(fā)酵條件，并對胞外多糖的抗氧化活性進(jìn)行探究，從而為黑芝菌液體發(fā)酵胞外多糖以及多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

菌種從浙江省野外黑芝中分離純化而得，經(jīng)鑒定為黑芝菌(Fructificatio amaurodermatis Rudae)，菌種編號FA003，目前保存于浙江省林業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g·L－1，葡萄糖 15 g·L－1，瓊脂15 ～20 g·L－1，自然 pH。

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯 100 g·L－1，葡萄糖 15 g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，KH2PO41 g·L－1，MgSO40.5 g·L－1。

搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，KH2PO41 g·L－1，MgSO40.5 g·L－1。

玉米粉、小麥粉、豆餅粉、麥麩來自上海三豐糧油有限公司。酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏購自武漢華辰生物技術(shù)有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)來自美國Sigma公司。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、苯酚、濃硫酸、乙醇、水楊酸、FeSO4、維生素C均為分析純。馬鈴薯市售。

1．2 儀器與設(shè)備

ZHWY-211B搖床發(fā)酵箱，上海智城分析儀器制造有限公司;752PC紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Anke DL-4000B冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1．3 試驗方法

1．3.1 菌種培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)［13－14］的方法，先從母種試管中切出蠶豆?fàn)畹木z塊，接種在斜面培養(yǎng)基，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d;然后從活化的斜面菌種中取種接于液體培養(yǎng)基，25℃、150 r·min－1振蕩培養(yǎng)7 d;最后在三角瓶中裝入搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液150 mL，按照10%的比例接入液體培養(yǎng)菌種，25 ℃、150 r·min－1振蕩培養(yǎng)。

1．3.2 胞外多糖含量測定

收集深層發(fā)酵培養(yǎng)液，3 000 r·min－1離心15 min，將上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入3～4倍體積的75%乙醇進(jìn)行醇析，4℃冰箱醇沉24 h，4 000 r·min－1離心15 min 得到沉淀物，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，即得胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)，然后采用苯酚硫酸法測定其含量［15］。

1．3.3 單因素試驗

碳源試驗:以蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、小麥粉、玉米粉分別取代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)7 d，選擇產(chǎn)生多糖含量最高的碳源開展10、15、20、25、30 g·L－1共5 個濃度的碳源梯度試驗，檢測胞外多糖的含量。

氮源試驗:以酵母粉、豆餅粉、麥麩、蛋白胨、牛肉浸膏，分別取代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉，按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)7 d，選擇產(chǎn)生多糖含量最高的氮源開展 2、4、8、12、16 g·L－1共5個濃度的氮源梯度試驗，檢測胞外多糖的含量。

發(fā)酵時間試驗:采用含20 g·L－1最高碳源和5 g·L－1最高氮源的搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按照1.3.1 節(jié)方法，培養(yǎng)2、3、4、5、6、7、8 d，適時取樣檢測胞外多糖的含量。

1．3.4 響應(yīng)面設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇蔗糖、酵母粉、發(fā)酵時間3個因素，運用Box-Behnken中心組合進(jìn)行試驗設(shè)計，利用Design Expert 8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析［16－18］。各試驗因素及水平編碼表見表1。

1．3.5 胞外多糖抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力的測定:參照Nsimba等［19］、張娜等［20］的方法，在波長 517 nm 處測定多糖溶液的吸光度，計算DPPH清除率。

式中:D1為多糖溶液的吸光度;D0為蒸餾水的吸光度。

·OH自由基清除能力的測定:參照WANG等［21］、徐懷德等［22］的方法，反應(yīng)體系中含 1.0 mL 8.8 mmol·L－1H2O2、1.0 mL 9.0 mmol·L－1FeSO4、1.0 mL 9.0 mmol·L－1水楊酸-乙醇溶液和1.0 mL不同濃度的多糖溶液。加H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm下測定吸光度。考慮到樣品本身吸光值，以1.0 mL 9.0 mmol·L－1FeSO4、1.0 mL 9.0 mmol·L－1水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL不同濃度多糖溶液和1.0 mL蒸餾水作為樣品的本底吸收值，計算樣品對·OH 的清除率［23］。

表1 試驗因素及水平編碼表Table 1 Experimental factors and horizontal code

其中:D0為空白對照吸光度;Dx為加入樣品溶液后吸光度;Dx0為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素試驗結(jié)果

2．1.1 碳源

從圖1可看出，蔗糖、葡萄糖、小麥粉和玉米粉都是黑芝菌發(fā)酵所需要的優(yōu)質(zhì)碳源，以蔗糖為碳源時，黑芝胞外多糖含量為218.66 mg·L－1，高于其他碳源，故后續(xù)試驗選擇蔗糖作為碳源。由圖2可知，多糖含量隨著蔗糖濃度的增加呈先升高后保持穩(wěn)定的趨勢，在蔗糖濃度為20 g·L－1時，黑芝胞外多糖的含量達(dá)到最大值218.78 mg·L－1。

2．1.2 氮源

圖1 不同碳源對液體發(fā)酵胞外多糖的影響Fig．1 Influence of different carbon sources on EPS yield

圖2 蔗糖濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig．2 Influence of sucrose concentrations on EPS yield

圖3 不同氮源對液體發(fā)酵胞外多糖的影響Fig．3 Influence of different nitrogen sources on EPS yield

由圖3可知，酵母粉、蛋白胨和牛肉浸膏都是較好的氮源。以酵母粉作為氮源時，黑芝胞外多糖含量為206.80 mg·L－1，高于蛋白胨以及其他氮源，故后續(xù)試驗選擇酵母粉作為氮源。由圖4可知，隨著酵母粉濃度的增加，胞外多糖的積累量也逐漸增加，酵母粉濃度超過8 g·L－1后，多糖的積累量趨于平穩(wěn)。

2．1.3 發(fā)酵時間

由圖5可知，發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵時間的延長，黑芝胞外多糖含量顯著增大，發(fā)酵6 d以后，胞外多糖的產(chǎn)量開始趨于平穩(wěn)。綜合考慮時間、產(chǎn)出比、影響效率等因素，選取5、6、7 d作為響應(yīng)面試驗中發(fā)酵時間的3個水平。

2．2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

圖4 酵母粉濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig．4 Influence of yeast powder concentrations on EPS yield

圖5 發(fā)酵時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig．5 Influence of fermentation time on EPS yield

根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，共有17個試驗組合，具體試驗結(jié)果見表2。

表2 黑芝液體發(fā)酵培養(yǎng)響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Response surface test results of liquid submerged fermentation

2．2.1 模型建立和顯著性分析

利用Design expert軟件對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和多元回歸擬合，建立以EPS為函數(shù)的二次回歸方程，并對回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表3。EPS(Y)與蔗糖(X1)、酵母粉(X2)和發(fā)酵時間(X3)的二次回歸方程為:9.96X3+227．18 。

從表3可知，本試驗所選用回歸模型具有良好的顯著性(P＜0.05)，失擬項 P=0.1013＞0.05，表明該模型失擬項不顯著。模型決定系數(shù)R2為0.954 6，表明此模型擬合度較好，校正系數(shù)Adj R2=0.896 2，說明該模型方程能夠解釋89.62%的響應(yīng)值變化，可用該回歸方程代替試驗真實點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析［24］，同時可以運用該模型方程進(jìn)行黑芝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測。另外，X1、X2、X3以及 X21、X22均比較顯著，說明它們對胞外多糖的合成有顯著影響。

2．2.2 響應(yīng)面分析

將模型中蔗糖、酵母粉及發(fā)酵時間的其中一個因素固定在0水平，得到另外2個因素的交互影響結(jié)果(圖6、圖7、圖8)。蔗糖和發(fā)酵時間的交互作用對胞外多糖得率影響最為顯著，相比而言，發(fā)酵時間和酵母粉、蔗糖和酵母粉的交互作用對胞外多糖得率影響較小，說明酵母粉對胞外多糖得率的協(xié)同作用不如蔗糖和發(fā)酵時間。

2．2.3 驗證性實驗

通過對回歸方程進(jìn)行一階偏導(dǎo)，得到以下3個方程:

表3 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for response surface test

圖6 蔗糖和酵母粉交互作用對黑芝胞外多糖含量的影響Fig．6 Influence of sucrose and yeast powder on EPS yield

圖7 蔗糖和發(fā)酵時間交互作用對黑芝胞外多糖含量的影響Fig．7 Influence of sucrose and fermentation time on EPS yield

圖8 酵母粉和發(fā)酵時間交互對黑芝胞外多糖得率的影響Fig．8 Influence of yeast powder and fermentation time on EPS yield

求解得出最佳培養(yǎng)條件為:蔗糖20.60 g·L－1，酵母粉 11.22 g·L－1，發(fā)酵時間 6.09 d。在此條件下，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達(dá)230.06 mg·L－1?？紤]到實際操作，培養(yǎng)條件調(diào)整為:蔗糖

20.6 g·L－1，酵母粉 11.2 g·L－1，發(fā)酵時間 6 d。在此條件下，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達(dá)237.35 mg·L－1。通過實驗證實，此時胞外多糖含量為236.83 mg·L－1，與理論值十分接近，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地預(yù)測黑芝胞外多糖產(chǎn)量。

2．3 抗氧化活性分析

由圖9和圖10可知，隨著黑芝胞外多糖濃度的增加，其對DPPH和羥基自由基的清除能力逐漸增強。多糖濃度為0.5 mg·mL－1時，對DPPH清除率達(dá)到63.87%，對羥基自由基清除率達(dá)到67.73%。多糖濃度超過0.5 mg·mL－1后，對自由基的清除率增加比較緩慢。總體上，胞外多糖對DPPH的清除率強于羥基，但低于陽性對照維生素C(VC)。黑芝胞外多糖的熱穩(wěn)定性高于VC，便于在食品加工中運用。

3 結(jié)論

圖9 黑芝胞外多糖對DPPH自由基的清除能力Fig．9 DPPH free radical scavenging ability of EPS

圖10 黑芝胞外多糖對羥基自由基的清除能力Fig．10 ·OH free radical scavenging ability of EPS

采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑芝菌液體發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖工藝，結(jié)果表明，適當(dāng)增加碳源和氮源含量，能有效提高多糖含量。優(yōu)化的黑芝菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的工藝參數(shù)為蔗糖20.6 g·L－1，酵母粉11.2 g·L－1，發(fā)酵時間 7 d。在此條件下，胞外多糖的含量可達(dá)到236.83 mg·L－1。濃度0～0.5 mg·mL－1時，黑芝菌胞外多糖對DPPH和羥基自由基的清除能力逐漸增強。此研究結(jié)果可為后續(xù)開展黑芝液體發(fā)酵技術(shù)研究提供一定的參考。