尹明華，占學林，徐文慧，謝妮妮，蔡 紅，陳榮華

(1．上饒師范學院生命科學學院，江西上饒334001;2．上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西上饒334700)

三葉青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)是中國特有的珍稀藥用植物，為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤，分布于中國長江中下游及南方地區(qū)海拔300～1 000 m的陰濕地區(qū)［1］。《中國植物志》記載三葉崖爬藤全株可供藥用，有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛等功效，可用于治療毒蛇咬傷、扁桃體炎、淋巴結結核、跌打損傷、小兒高熱驚厥等［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，三葉青具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)痛解熱、調(diào)節(jié)免疫等作用，并廣泛用于多種中成藥或保健品［3］。目前，三葉青的研究報道主要集中于植物學、化學成分、毒理藥理學、臨床應用、人工栽培、生物技術等方面［4］，而三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性研究少有報道。袁帶秀等［5－6］首次對湘南湘西3個不同產(chǎn)地的三葉青種質(zhì)資源親緣關系進行了過氧化酶(POD)和酯酶同工酶檢測，結果顯示它們是3個獨立的物種;朱波等［7］利用 inter-simple sequence repeat(ISSR)分子標記技術對24份種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行了研究，并將浙江種質(zhì)全部聚為第Ⅰ類，江西、廣西、湖北、湖南等種質(zhì)聚為第Ⅱ類，湖南懷化與廣西鐘山種質(zhì)聚為第Ⅲ類，貴州種質(zhì)單獨聚為第Ⅳ類。該研究樣本數(shù)量和樣本選取地偏少，且分子生物學技術在三葉青遺傳多樣性中的應用研究還處于起步階段，應在加強三葉青種質(zhì)資源收集的基礎上繼續(xù)采用其他DNA分子標記來進行深入研究，以保護我國特有的珍稀藥用植物資源。隨機擴增多態(tài)DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術是由美國科學家 Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的一種基于PCR的分子標記技術［8］，可在沒有基因組信息且特異性標記較少條件下進行，具有DNA樣品用量少、操作簡單易行、分析速度快、易檢測、實驗成本低等優(yōu)點，目前已在國內(nèi)外很多物種的分類及遺傳多樣性分析中被廣為應用［9］。三葉青基因組還沒有測序，僅有極少數(shù)基因克隆，無法大量開發(fā)簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和表達序列標簽(expressed sequence tags，ESTs)標記，研究起來進展緩慢，而RAPD標記能夠在未知序列的情況下快速方便找到差異。目前，我國三葉青種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關系的分子標記研究仍不全面，可通過擴大群體數(shù)量，增加近緣種和野生種數(shù)量來探討遺傳多樣性和親緣關系，以便在品種選育中更好地選擇中間材料，減少盲目性。雖然RAPD會產(chǎn)生假陽性，但可通過提高退火溫度來保證實驗的準確性［10－13］。另外，本課題組的預實驗表明，RAPD分子標記在不同三葉青種質(zhì)中均能獲得較高的多態(tài)性比率，是理想的多態(tài)性篩選、種質(zhì)資源鑒定的分子標記類型，可以用于三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。因此，本研究擬采用RAPD技術對64份三葉青種質(zhì)的遺傳多樣性進行檢測，旨在探明三葉青種群的遺傳多樣性水平，為合理保護三葉青的基因資源及其遺傳改良提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

64個三葉青樣本(表1)采自上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司位于懷玉山的三葉青種質(zhì)資源庫和三葉青品種園。

1．2 方法

1．2.1 基因組DNA的提取

采用CTAB法提取樣品基因組DNA［14］。

1．2.2 引物篩選與RAPD分析

用40對引物(表2)對4個樣品(隨機選擇樣本1、樣本24、樣本33和樣本62)進行PCR擴增，篩選出10對引物進行批量實驗［15］。PCR擴增體系(20 μL):2 μL DNA 模板，1 μL 引物，10 μL 2×Taq PCR Mastermix buffer(北京博友順生物技術有限公司)，7 μL去離子水。PCR擴增程序為:94℃ 3 min;94℃ 30 s，36℃ 50 s，72℃ 1.5 min，40個循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。

1．2.3 數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。RAPD擴增產(chǎn)物電泳圖譜中的每1條帶均視為1個分子標記(DL 2 000 DNA marker)，代表一個引物的結合位點。按凝膠同一位置上DNA帶的有無進行統(tǒng)計，有帶(包括弱帶)的記為“1”，無帶的記為“0”，構成RAPD表型數(shù)據(jù)矩陣用于分析。采用POPGENE 1.31軟件對全部種群和各個單種群分別進行遺傳參數(shù)分析［16］，分別計算觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、多態(tài)位點和多態(tài)百分數(shù)(%);利用NTSYS軟件計算相似系數(shù)(DICE系數(shù))，并且按照遺傳距離進行UPGMA聚類分析。

表1 三葉青64個樣本信息Table 1 Information of 64 Tetrastigma hemsleyanum samples

續(xù)表1

2 結果與分析

2．1 引物篩選結果

40對RAPD引物的篩選結果見圖1，篩選出至少能擴增出2條及以上多態(tài)性條帶的10對引物進行批量實驗。10對引物分別是 HSD1、HSD3、HSD6、HDS9、HSD14、HSD16、S10、S12、S19、S20。

2．2 RAPD引物擴增多態(tài)性

利用篩選出的10條引物對64個三葉青DNA樣本進行PCR擴增，其中引物P1(HSD1)對64個三葉青樣本的PCR擴增產(chǎn)物檢測結果見圖2，10條引物PCR擴增結果見表3。在64個三葉青樣本中共檢測到80個DNA位點，平均每條引物擴增出8個DNA位點，有75個多態(tài)性位點，多態(tài)性位點比率(PPB)為93.75%。10條RAPD引物擴增的DNA位點數(shù)為4～11個，多態(tài)性位點比率為66.67% ～100%;其中，多態(tài)性比率最低的為引物 P3(HSD3)，為 66.67%，而引物 P30(S10)擴增出的DNA位點為4，位點數(shù)最少，但多態(tài)性位點比率最高，達100%。表明10條RAPD引物具有較好的多態(tài)性，64個三葉青樣本的遺傳多樣性比較豐富。每條引物平均擴增出8個DNA位點和7.5個多態(tài)性位點，擴增產(chǎn)生的DNA片段長度為100～2 000 bp。結果表明，采用不同的RAPD引物對64個三葉青樣本進行PCR擴增，擴增出的位點數(shù)差異較大，多態(tài)性位點的比例差異也較大。

表2 RAPD引物信息Table 2 Information of RAPD primers

圖1 40對RAPD引物的PCR電泳圖Fig．1 PCR electrophoresis of 40 RAPD primers

表3 RAPD-PCR擴增的引物及擴增結果Table 3 RAPD primers used for RAPD-PCR amplification and their amplification results

圖2 引物P1(HSD1)對64個三葉青樣本的PCR擴增產(chǎn)物檢測結果Fig．2 Detection results of PCR amplification products of 64 Tetrastigma hemsleyanum samples using P1(HSD1)primer

2．3 三葉青的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析(表4)表明，64個三葉青樣本的觀測等位基因數(shù)(Na)為1.666 7～2.000 0，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.247 9～1.701 3，Nei's基因多樣性指數(shù)為0.167 0～0.398 4，Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.262 8～0.583 0，平均多態(tài)位點為7.5，平均多態(tài)百分數(shù)為93.15%。

2．4 三葉青的遺傳關系聚類分析

10對引物在64個樣品中共獲得80條擴增片段。利用NTSYS軟件計算樣品間的遺傳相似系數(shù)(GS值)，得到供試材料遺傳相似矩陣。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關系越近，遺傳相似系數(shù)越小，親緣關系越遠。根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA法進行聚類分析，得到UPGMA聚類分析圖(圖3)。

在遺傳相似系數(shù)0.720 56處，可以將64個三葉青樣本分成11大類:第Ⅰ類包括樣本1(JXHY1)、29(GDSG)、60(JXNF)、33(JXDX)、52(JXWY)、42(AHHS1)、53(AHHS2)、34(ZJNN)、39(JXYY)、56(FJGZ)、28(GDSX)、51(JXFC);第Ⅱ類包括樣本47(FJWYS)、61(JXNC)、54(JXGX)、46(ZJFY)、48(ZJTZ)、49(FJSM)、62(ZJJH)、64(FJJY);第Ⅲ類包括樣本 26(YNWS)、27(GZMT)、30(TWAL)、31(HNJFL)、41(JXYS1);第Ⅳ類包括樣本 2(HBYZ)、57(JXAY)、35(FJPC)、20(GZHGS)、21(GXLS1)、22(GXCR)、40(JXHY2)、38(ZJNB 1);第Ⅴ類包括樣本37(ZJCA)、43(JXYS2);第Ⅵ類包括樣本 3(CQZWY)、4(HNJS)、5(HNZJJ1)、6(CQCN)、8(HNYL)、9(CQPS)、13(HBXDS)、14(ZJWZYJ)、10(CQJFS)、15(HNZJJ2)、16(GXLY1)、11(HNFH)、12(SCEMS);第Ⅶ類包括樣本19(GXGL)、59(ZJKH)、32(JXJGS)、55(ZJZS)、44(ZJNB2)、45(ZJLIS)、50(ZJNB3)、58(JXYT)、23(GXLS2)、24(YNML);第Ⅷ類包括樣本7(HNHH)、18(GXLY2)、25(GXLS3);第Ⅸ類包括樣本36(ZJSC);第Ⅹ類包括樣本17(GXBS);第Ⅺ類包括樣本63(JXYH)。

表4 引物的多態(tài)性數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 4 Polymorphic data statistics of primers

圖3 基于RAPD標記的64個三葉青的UPGMA親緣關系聚類圖Fig．3 The UPGMA genetic relationship clustering map of 64 Tetrastigma hemsleyanum samples based on RAPD molecular markers

在遺傳相似系數(shù)0.697 04處，則可將64個三葉青樣本分成4大類:第Ⅰ類包括樣本63(JXYH);第Ⅱ類包括樣本17(GXBS);第Ⅲ類包括樣本7(HNHH)、18(GXLY2)、25(GXLS3)、36(ZJSC);剩下58個樣本均屬于第Ⅳ類。

3 討論

三葉青是我國特有的瀕危珍稀藥用植物，已有多年藥用歷史，主產(chǎn)于浙江、湖南、江西、福建、廣西、重慶、湖北、四川、廣東、貴州等地［17］。我國三葉青主要有2個品種:青色藤三葉青(主產(chǎn)于福建、湖南、四川、廣東、廣西和云南的部分地區(qū)，27.3°N以南)和褐紫藤三葉青(主產(chǎn)于江西和浙江山區(qū)，27.3°N 以北)［18］。隨著越來越多種類和數(shù)量的分子標記被開發(fā)，分子標記技術在各種植物的分子遺傳圖譜構建、品種鑒定與純度分析、重要經(jīng)濟性狀相關基因定位以及種質(zhì)資源多樣性分析等領域中應用已十分廣泛［19］。王一涵［20］基于雙重抑制法開發(fā)了8對有多態(tài)性的三葉青特異性微衛(wèi)星引物，基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的STRUCTURE聚類分析結果表明，三葉青群體可劃分為4個地理分組，分別對應于中國西南部、中部、東部和南部地區(qū)(包括海南)。朱波等［7］利用ISSR分子標記技術對三葉青全國主分布區(qū)24份種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行了研究，也發(fā)現(xiàn)種質(zhì)聚類分析結果與地理分布密切相關。Peng等［21］采用SRAP和ISSR標記對27個三葉青野生或栽培居群的遺傳多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)樹狀圖顯示了三葉青的地理分布集群模式。

RAPD具有操作簡便、不需提前知道材料基因信息、檢測靈敏、多態(tài)性強等特點，是目前研究植物遺傳變異、植物遺傳多樣性、植物品種鑒定等方面廣泛采用的一種分子標記法［22］。在實際應用中，RAPD技術可以在物種沒有任何分子生物學研究水平的背景下，對其基因組進行多態(tài)性分析［23］，而且成本較低，操作簡單，引物來源廣泛，這對于遺傳背景研究相對較少的三葉青來說較為適宜。

在本實驗中，來源于江西懷玉山太陽坑、江西南豐泰和鎮(zhèn)果村、江西德興暖水、江西婺源段莘鄉(xiāng)五龍山、江西豐城市玉華山、江西弋陽三縣嶺的三葉青與來源于安徽黃山玉屏景區(qū)、安徽黃山鳳凰源景區(qū)、浙江景寧大漈、廣東韶光仁化縣、廣東始興都亨鄉(xiāng)、福建光澤的三葉青聚為第Ⅰ類;來源于江西南昌梅嶺梅谷、江西貴溪樟坪畬族鄉(xiāng)、江西貴溪樟坪畬族鄉(xiāng)的三葉青與來源于福建武夷山天心永樂寺、浙江富陽新登外官、浙江臺州三門縣花橋、福建三明三元吉口、浙江金華武義柳城、福建建陽華家山林場的三葉青聚為第Ⅱ類;來源于江西玉山橫街清溪的三葉青與來源于云南文山縣古木鎮(zhèn)、貴州湄潭茅坪、臺灣阿里山、海南尖峰嶺森林公園的三葉青聚為第Ⅲ類;來源于江西安遠老鼠嘴、江西懷玉山金剛峰的三葉青與來源于湖北永州黃田鋪、福建蒲城縣筊杯巖、貴州黃果樹景區(qū)、廣西龍勝銀水侗寨、廣西崇仁明仁、浙江寧波天童寺南山的三葉青聚為第Ⅳ類;來源于江西玉山必姆坳村的三葉青與來源于浙江淳安大市花石源的三葉青聚為第Ⅴ類;來源于重慶藥用植物園、湖南吉首德夯、湖南張家界森林公園、重慶潼南縣上和鎮(zhèn)、湖南沅陵清水坪、重慶彭水、湖北星斗山、重慶金佛山山泉鎮(zhèn)、湖南張家界金鞭溪、廣西樂業(yè)龍角山、湖南鳳凰南華植物園、四川峨眉山清音閣卻與來源于浙江溫州永嘉四海山的三葉青聚為第Ⅵ類;來源于江西井岡山、江西鷹潭龍虎山的三葉青與來源于廣西桂林植物研究所、浙江開化洪源、浙江舟山白泉鎮(zhèn)、浙江寧波天童寺鐘樂海、浙江麗水蓮都東西巖、寧波市天童寺小天童、廣西龍勝花坪紅毛沖、云南麻栗坡中寨村的三葉青聚為第Ⅶ類;來源于湖南懷化綏寧縣黨坪、廣西樂業(yè)龍角山、廣西桂林龍勝粗江的三葉青則聚為第Ⅷ類;來源于浙江遂昌白馬山的三葉青單獨成為第Ⅸ類;來源于廣西百色富寧的三葉青單獨成為第Ⅹ類;來源于江西宜黃徐坊鎮(zhèn)鄧家的三葉青單獨成為第Ⅺ類。以上分類結果表明，三葉青種質(zhì)資源的遺傳多樣性較高，與群體的地理分布并沒有顯著的相關性，與前人研究結果不同。究其原因，朱波等［7］指出，可能是所取材料均為一個種，屬于種內(nèi)變異，相比種間或居群間變異小，其次，可能是種源地組成較為單一;Peng等［13］也認為，群體內(nèi)遺傳相似性高于群體間，栽培群體間的遺傳相似性遠高于野生群體，可能是基因流水平低、距離隔離和無性繁殖所致。袁帶秀等［5－6］對3個不同種源地三葉青酯酶同工酶和POD同工酶進行比較研究，發(fā)現(xiàn)小貓兒村三葉青與州黨校三葉青的親緣關系較近，與永順三葉青的親緣關系較遠。這也為三葉青遺傳多樣性不一定與地理分布相關提供了一些依據(jù)。在本實驗中，聚類分析的結果與種源的地理距離也存在不一致性，這可能與種源地的地形、氣候等自然因素有關。而且這些種源都采集于懷玉山種質(zhì)資源庫，三葉青對種質(zhì)資源庫的氣候、地形、土壤等條件的適應可能也會導致個體遺傳性狀的改變，從而導致聚類分析的結果錯綜復雜。

多態(tài)性位點的豐富程度間接反映了種群遺傳多樣性的豐富程度［24］。種群中的多態(tài)性位點多，表明群內(nèi)物種間遺傳變異的水平較高，種群遺傳多樣性豐富，對環(huán)境有較強的適應能力;反之，如果其多態(tài)性位點較少，則表明該物種的遺傳多樣性較差，對環(huán)境沒有較好的適應能力，在自然選擇的過程中處于劣勢［25］。在本研究驗中，64個三葉青樣本的觀測等位基因數(shù)(Na)為1.666 7～2.000 0，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.247 9～1.701 3，Nei's基因多樣性指數(shù)為0.167 0～0.398 4，Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.262 8～0.583 0，平均多態(tài)位點為7.5，平均多態(tài)百分數(shù)為93.75%，說明64個三葉青樣本的遺傳多樣性較為豐富，對高山環(huán)境有較強適應力。