婁 玲，穆雙雙，胡 德，湯 磊，劉俊澤，王淑敏

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

葉生小皮傘，學(xué)名Marasmius epiphyllus（Pers.)Fr.，屬于傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 小 皮 傘 科 （Basidiomycetes） 小 皮 傘 屬（Marasmius） 真菌[1]。主要形態(tài)特征是：擔(dān)子果小，菌蓋堅(jiān)韌，在菌褶和菌柄間時(shí)有一“項(xiàng)圈”（collar）；孢子卵形至橢圓形，光滑，無色，非淀粉質(zhì)反應(yīng)[2-3]。夏秋季生于林內(nèi)落葉上或地上，分布于我國(guó)吉林、福建、廣西等地[4]。

近年我國(guó)對(duì)小皮傘的研究不多，僅在一些野外調(diào)查報(bào)告中會(huì)提及少數(shù)種，如圖力古爾[5]、吳興亮等[6]對(duì)個(gè)別種類的報(bào)道[7]，幾乎沒有其他關(guān)于葉生小皮傘菌研究的相關(guān)報(bào)道。通過單因素考察和正交試驗(yàn)，確定了葉生小皮傘菌生長(zhǎng)最適宜的碳源、氮源、微量元素和生長(zhǎng)條件，為葉生小皮傘菌的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

葉生小皮傘菌株，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)菌物藥研究室提供。

1.1.2 儀器

LDZX-50KBS高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；WMK-02型電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；303AB-2恒溫培養(yǎng)箱，上海申光儀器儀表有限公司；AUY220萬分之一分析天平，島津制作所。

1.1.3 試劑

葡萄糖購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；硫酸銨購(gòu)自天津市美華泰克科技有限公司；脲購(gòu)自廣東汕頭市西隴化工廠；VB1購(gòu)自大同市云岡制藥有限公司；KH2PO4購(gòu)自西隴化工有限股份公司；乳糖、蔗糖、硝酸銨、HCl、NaOH、豆餅粉、麥麩、玉米粉和乙醇均購(gòu)自北京化工廠；木糖、瓊脂粉、MgSO4和Ca CO3均購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；麥芽糖、蛋白胨和酵母浸粉均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 培養(yǎng)基的組成

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、瓊脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉浸汁4%、馬鈴薯20%、瓊脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然；蔗糖2%、馬鈴薯20%、瓊脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然；葡萄糖2%、馬鈴薯20%、瓊脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然。

微量元素基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米浸汁4%、硝酸銨0.2%、馬鈴薯20%、瓊脂2%，pH自然；蔗糖2%、酵母粉1%、馬鈴薯20%、瓊脂2%，pH自然。

正交培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)：分別以蔗糖、酵母、Mg SO4以及KH2PO4為因素，按表1的L9（34）正交表的比例制備培養(yǎng)基。

pH試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為馬鈴薯20%、蔗糖1%、酵母粉0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。

溫度試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為馬鈴薯20%、蔗糖1%、酵母粉0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。

1.2 試驗(yàn)方法

菌株經(jīng)連續(xù)20代的傳代培養(yǎng)后，菌絲形態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)基本不變，在4℃環(huán)境下保存約1個(gè)月，菌絲形態(tài)依然一致，就可以確定葉生小皮傘菌株已基本純化，可用于試驗(yàn)。每組按培養(yǎng)基組成，平行配制3支試管，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，無菌操作切出大小為0.25 cm2的菌塊接于培養(yǎng)基上，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中。自萌發(fā)日開始每日記錄菌絲狀態(tài)，測(cè)量菌落面積，比較菌絲生長(zhǎng)速度[8]。

1.2.1 碳源的影響

碳源依次為：空白、葡萄糖濃度2%、蔗糖濃度2%、木糖濃度2%、乳糖濃度2%、麥芽糖濃度2%、玉米面浸出液濃度4%。共7組考察試驗(yàn)。

1.2.2 氮源的影響

氮源依次為：空白、酵母粉濃度1%、蛋白胨濃度2%、豆餅粉浸汁濃度 4%、麥麩浸汁濃度4%、尿素濃度0.2%、硫酸銨濃度0.2%、硝酸銨濃度0.2%。共8組考察試驗(yàn)。

1.2.3 微量元素的影響

微量元素依次為：空白、MgSO4濃度0.15%、KH2PO4濃度0.15%、VB1濃度0.05%、NaH2SO4濃度0.15%、CaO濃度0.1%、MgSO4濃度 0.10%以及KH2PO4濃度0.15%。共8組考察試驗(yàn)。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

按營(yíng)養(yǎng)元素考察結(jié)果進(jìn)行篩選，按表1的L9（34）正交表比例來制備培養(yǎng)基。

表1L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factor level of L9(34)orthogonal test

1.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

1.3.1 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

按正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)培養(yǎng)基配比制備培養(yǎng)基，用0.1 mol·L-1HCl和 20%NaOH調(diào)節(jié) pH，使其 pH分別為 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、9.0。

1.3.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

按正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果制備培養(yǎng)基，放置于不同溫度下，溫度分別為15℃、20℃、25℃、30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

碳源對(duì)葉生小皮傘菌菌株生長(zhǎng)速度的影響結(jié)果見表2、圖1。

由表2和圖1可以看出，6種碳源中菌株均可生長(zhǎng)，其中玉米粉、蔗糖、葡萄糖3種碳源中葉生小皮傘菌能以較快的速度生長(zhǎng)，且長(zhǎng)勢(shì)旺盛、無雜菌污染，因此分別以玉米粉、蔗糖、葡萄糖3種碳源作為基礎(chǔ)碳源進(jìn)行氮源的考察。

表2 不同碳源對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)速度的影響Tab.2 Effects of different carbon sources on the growth rate of Marasmius epiphyllus

圖1 不同碳源培養(yǎng)基中葉生小皮傘生長(zhǎng)速度的變化Fig.1 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different carbon source mediums

2.2 不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

玉米粉浸汁組、蔗糖組、葡萄糖組不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)速度的影響結(jié)果分別見表3和圖2、表4和圖3、表5和圖4。

由表3和圖2可知，在玉米粉浸汁組中，除以尿素為氮源外，其余6種氮源中葉生小葉皮傘菌株均可正常生長(zhǎng)，其中以蛋白胨為氮源時(shí)菌株生長(zhǎng)速度最快，其次是硝酸銨，二者相比菌株長(zhǎng)勢(shì)相近，但以硝酸銨為氮源的菌絲較以蛋白胨為氮源的菌絲更加濃厚，因此玉米浸汁組選擇硝酸銨為最佳氮源。

表3 玉米粉浸汁組不同氮源對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)速度的影響Tab.3 Effects of different nitrogen sources on the growth rate of Marasmius epiphyllus in corn flour juice group

表4 蔗糖組不同氮源對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effects of different nitrogen sources on the growth of Marasmius epiphyllus in the sucrose group

表5 葡萄糖組不同氮源對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)速度的影響Tab.5 Effects of different nitrogen sources on growth rate of Marasmius epiphyllus in glucose group

圖2玉米浸汁組不同氮源培養(yǎng)基中葉生小皮傘生長(zhǎng)速度的變化Fig.2 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different nitrogen source mediums in corn dip juice group

圖3 組不同氮源培養(yǎng)基中葉生小皮傘生長(zhǎng)速度的變化Fig.3 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different nitrogen source mediums in sucrose group

圖4 糖組不同氮源培養(yǎng)基中葉生小皮傘生長(zhǎng)速度的變化Fig.4 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different nitrogen source mediums in glucose group

由表4和圖3可知蔗糖組中，除以尿素為氮源外，其余6種氮源中葉生小傘皮菌株均可正常生長(zhǎng)，其中以麥麩汁為氮源時(shí)菌株生長(zhǎng)速度最快，其次是酵母粉，雖然二者相比長(zhǎng)勢(shì)相近，但以酵母粉為氮源的菌絲比以麥麩汁為氮源的菌絲更加濃厚，因而蔗糖組的最佳氮源選擇酵母粉。

由表5和圖4可知，除以尿素為氮源時(shí)葉生小皮傘菌株生長(zhǎng)較慢外，其余6種氮源中菌株均可快速生長(zhǎng)，其中以硝酸銨為氮源時(shí)菌株生長(zhǎng)速度最快，其次是麥麩汁，雖然二者相比長(zhǎng)勢(shì)相近，但以麥麩汁為氮源的菌絲更加濃厚，因而葡萄糖組最佳的氮源為麥麩汁。

綜合比較3組，葡萄糖組的菌絲生長(zhǎng)速度不如玉米浸汁組和蔗糖組，菌絲也沒有其他2組濃密，因而舍棄葡萄糖組。氮源組最終篩選的結(jié)果為玉米粉浸汁加硝酸銨、蔗糖加酵母粉，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行微量元素的考察。

2.3 微量元素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

玉米粉浸汁加硝酸銨組、蔗糖加酶母粉組不同微量元素對(duì)葉生小皮傘菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果分別見表6和圖5、表7和圖6。

由表6和圖5可知玉米浸汁加硝酸銨組中，除添加CaO抑制葉生小皮傘菌株生長(zhǎng)外，添加其余5種微量元素時(shí)菌株均可快速生長(zhǎng)，其中以VB1為微量元素的菌株生長(zhǎng)速度最快且菌絲濃厚，因此玉米浸汁加硝酸銨組中，最佳微量元素為VB1。

由表7和圖6可知蔗糖加酶母粉組中，除添加CaO的菌株生長(zhǎng)速度較慢外，添加其余5種微量元素時(shí)菌株均可快速生長(zhǎng)，其中以MgSO4加KH2PO4為微量元素的菌株生長(zhǎng)速度最快且菌絲濃厚，因而蔗糖加酶母粉組中，選擇MgSO4加KH2PO4為最佳的生長(zhǎng)元素。

表6 玉米粉浸汁加硝酸銨組不同微量元素對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)速度的影響Tab.6 Effects of different trace elements on the growth rate of Marasmius epiphyllus in corn flour juice and ammonium nitrate group

表7 蔗糖加酵母粉組不同微量元素對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)速度的影響Tab.7 Effects of different trace elements on the growth rate of Marasmius epiphyllus in sucrose and yeast extract group

圖5 玉米浸汁加硝酸銨組不同微量元素中葉生小皮傘生長(zhǎng)速度的變化Fig.5 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different trace element mediums in corn flour juice and ammonium nitrate group

綜合比較2組，2組長(zhǎng)勢(shì)相近，但蔗糖加酶母粉組的菌絲較玉米浸汁加硝酸銨組的更加濃厚，因此舍棄玉米浸汁加硝酸銨組，最終的培養(yǎng)基組成為蔗糖、酵母粉、MgSO4

加KH2PO4。

2.4 正交培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

正交培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果極差分析結(jié)果見表8、方差分析結(jié)果見表9。

圖6 蔗糖加酵母粉組不同微量元素培養(yǎng)基中葉生小皮傘生長(zhǎng)速度的變化Fig.6 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different trace element mediums in sucrose and yeast extract group

通過表9可以得出，4種因素對(duì)葉生小皮傘菌株的影響順序是：蔗糖＞MgSO4＞酵母粉＞KH2PO4。最終確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成的配比為：蔗糖濃度1%、酵母粉濃度0.5%、MgSO4濃度為0.05%、KH2PO4濃度為0.1%。

2.5 不同pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

不同pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響結(jié)果見表10、圖7。

由表10和圖7可知，葉生小皮傘菌在pH值為5～6的范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度最快、長(zhǎng)勢(shì)旺盛，pH值越大，菌株生長(zhǎng)速度越緩慢，因此表明葉生小皮傘菌更適宜在弱酸性條件下生長(zhǎng)。

2.6 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)速度的影響

表8 正交試驗(yàn)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的極差分析表Tab.8 Range analysis table for optimization results of orthogonal test medium

表9 方差分析表Tab.9 Variance analysis table

表10 不同pH對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)的影響Tab.10 Effects of different pH on the growth of Marasmius epiphyllus

不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)速度的影響，結(jié)果見表11、圖8。

圖7 不同pH的葉生小皮傘生長(zhǎng)速度變化Fig.7 Changes in growth rate of Marasmius epiphyllus with different pH

表11 不同溫度對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)速度的影響Tab.11 Effect of different temperatures on the growth rate of Marasmius epiphyllus

圖8 不同溫度葉生小皮傘生長(zhǎng)速度變化Fig.8 Changes in growth rate of Marasmius epiphyllus with different temperatures

由表11和圖8可知，葉生小皮傘菌最適溫度為25℃～30℃，溫度過低和過高時(shí)會(huì)抑制葉生小皮傘菌的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

以葉生小皮傘菌絲的生長(zhǎng)速度為考察指標(biāo)，研究不同條件對(duì)葉生小皮傘菌生長(zhǎng)速度的影響，確定了葉生小皮傘菌在pH為5～6、溫度為25℃～30℃的條件下，生長(zhǎng)速度較快。根據(jù)正交培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定葉生小皮傘菌最適生長(zhǎng)條件為：蔗糖濃度1%、酵母粉濃度0.5%、MgSO4濃度0.05%、KH2PO4

濃度0.1%，pH為5～6，溫度為25℃～30℃。碳氮源為真菌菌絲體提供了生長(zhǎng)和代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]，通過對(duì)碳源、氮源的考察試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除氮源中的尿素和微量元素中的氧化鈣對(duì)葉生小皮傘菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制外，其余物質(zhì)均可使葉生小皮傘菌以較快速度生長(zhǎng)，這表明葉生小皮傘菌株的生長(zhǎng)力旺盛。蔗糖、玉米浸汁、葡萄糖中菌株均可以較快速度生長(zhǎng)，說明菌株可利用的碳源廣泛。從條件因素考察得知，葉生小皮傘菌喜好弱酸性環(huán)境，強(qiáng)堿環(huán)境會(huì)抑制葉生小皮傘菌株的生長(zhǎng)。試驗(yàn)篩選出最適宜葉生小皮傘菌生長(zhǎng)的條件，為葉生小皮傘菌進(jìn)一步的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。