郭燕妳，許海濤，吳西麗

(廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 518106)

乙型肝炎病毒(HBV)感染率非常高，據(jù)報道目前全球有感染者近20億，其中慢性乙型肝炎約3.5億，我國HBV人群攜帶率達(dá)15%以上，現(xiàn)有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性者約9 300萬，每年新發(fā)感染者10萬例[1]。HBV感染會導(dǎo)致肝臟病變及多種肝外病變，嚴(yán)重危害患者健康。HBV相關(guān)性腎炎(HBV-GN)是最常見的肝外病變之一[2-3]。盡管膜性腎病是HBV-GN最常見的病理分型，其進(jìn)展緩慢，但有研究稱近30.0%的患者最終會進(jìn)展為末期腎病[4]。因此，能夠早期明確診斷HBV-GN對患者意義重大，能夠為臨床醫(yī)生優(yōu)化治療方案提供參考并降低終末期腎病的發(fā)生率。傳統(tǒng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)是通過腎穿刺進(jìn)行組織活檢，盡管腎穿刺能夠直觀地發(fā)現(xiàn)腎小球變化，但是腎穿刺存在許多弊端[5]。因此，臨床上迫切需要一種新的HBV-GN診斷方法及指標(biāo)。本文研究了HBsAg定量檢測與尿液中HBV-DNA的相關(guān)性，并分析了二者聯(lián)合檢驗對HBV-GN的診斷效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2016年6月至2017年12月就治于本院腎內(nèi)科及感染科的腎炎患者110例，其中男72例，女38例，年齡26～57歲，平均年齡(41.7±4.5)歲。分為HBV-GN組60例，非HBV相關(guān)腎性炎(Non-HBV-GN)組50例。HBV-GN的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]：(1)血清HBV抗原陽性；(2)排除狼瘡性腎炎、過敏性紫癜及糖尿病等疾病引發(fā)的腎小球腎炎；(3)腎切片上找到HBV抗原，本項為基本條件，若為陰性不能診斷HBV-GN。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在穿刺的相對或者絕對禁忌證者；(2)病案缺失者。所有病例患者或其直系親屬簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會審批。兩組患者的年齡、性別、病程及臨床表現(xiàn)等基本資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2方法

1.2.1病理診斷 兩組患者均在B超定位下行經(jīng)皮腎穿刺，由兩名本院病理科副主任醫(yī)師協(xié)商做出病理診斷，若存在爭議，則由1名病理科主任醫(yī)師做出最終診斷。標(biāo)本處理：用生理鹽水浸濕小塊紗布，至手剛好擰不出水來為佳，標(biāo)本放入紗布后，一并放入空小瓶中，放入冰盒中送檢[8]。

1.2.2乙型肝炎標(biāo)志物檢測 采用發(fā)光法測定患者HBsAg及HBeAg，發(fā)光試劑盒購自強生生物技術(shù)有限公司[9-10]。所用儀器亦為強生Vitros 5600生化儀。

表1 兩組患者的一般資料

1.2.3尿液HBV-DNA檢測 收集患者中段晨尿15 mL，3 000 r/min離心10 min，采用購自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的DNA提取試劑盒提取患者尿液中的HBV-DNA，用PCR技術(shù)定量檢測患者尿液中的HBV-DNA，采用美國ABI7500 PCR儀進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)條件：93 ℃下2 min，93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s→10個循環(huán)，93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s→30個循環(huán)。陽性界定：尿液HBV-DNA載量≥100 copy/mL[11]。

1.2.4受試者工作特征曲線(ROC曲線) ROC曲線又稱為感受性曲線，以靈敏度為縱坐標(biāo)，(1-特異度)為橫坐標(biāo)。ROC曲線越靠近左上角,該診斷方法的準(zhǔn)確性就越高，比較各種診斷方法的ROC曲線下的面積(AUC)，AUC最大的即為最優(yōu)的診斷方法[12]。約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1，是評價篩查試驗真實性的方法，表示發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的總能力。指數(shù)越大說明篩查實驗的效果越好，真實性越大[13]。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者腎炎病理分型的比較 HBV-GN組以膜性腎病為主(51.7%)；而Non-HBV-GN組以毛細(xì)血管內(nèi)增生性腎炎為主(30.0%)，兩組患者的腎炎病理分型差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.309，P<0.05)，見表2。

2.2兩組患者的乙型肝炎標(biāo)志物檢測結(jié)果比較 HBV-GN組患者的血清HBsAg、血清HBeAg及尿液HBV-DNA的定量和定性檢測均高于Non-HBV-GN組(均P<0.05)，其中血清HBsAg定量、尿液HBV-DNA的定量和定性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.3HBV-GN組HBsAg定量與尿液HBV-DNA的相關(guān)性分析 HBeAg陽性患者的HBsAg定量及尿液HBV-DNA拷貝數(shù)均顯著高于HBeAg陰性患者(P<0.05)；HBeAg陽性、陰性患者HBsAg定量與尿液HBV-DNA拷貝水平均有相關(guān)性(r=0.718、0.314，P<0.05)，見表4。

表2 兩組患者腎炎的病理分型結(jié)果[n(%)]

表3 兩組患者乙型肝炎標(biāo)志物檢測結(jié)果比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

表4 HBV-GN組HBsAg定量與尿液HBV-DNA的相關(guān)性分析

2.4HBsAg定量、尿液HBV-DNA及二者聯(lián)合檢測診斷HBV-GN的ROC曲線分析 HBsAg定量與尿液HBV-DNA聯(lián)合檢測診斷的靈敏度和特異度最高的，其次是尿液HBV-DNA檢驗，最差的是HBsAg定量檢測，見圖1及表4。

圖1 ROC曲線

2.5HBsAg定量、尿液HBV-DNA及二者聯(lián)合檢測對HBV-GN的診斷效能 HBsAg定量與尿液HBV-DNA檢測相比，靈敏度及特異度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合檢測的靈敏度及特異度均優(yōu)于HBsAg定量和尿液HBV-DNA單獨檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 對HBV-GN的診斷效能分析

注：與聯(lián)合檢測相比，△P<0.05,□P<0.05

3 討 論

HBV感染已經(jīng)成為全球面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，據(jù)GANEM等[14]報道，全球約有20億人感染過HBV，每年有近100萬人死于感染HBV后導(dǎo)致的肝衰竭及肝硬化等相關(guān)疾病。然而HBV感染可累及患者多個器官，對腎臟等也會產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。早在20世紀(jì)70年代，COMBES等就發(fā)現(xiàn)HBV感染和腎小球疾病的關(guān)系[15]。膜性腎病是最常見的病理分型，本研究中膜性腎病占51.7%，與潘楚瑛等[16]研究報道的50.0%接近。HBV-GN患者可有血尿、水腫、高血壓及低蛋白血癥等腎炎表現(xiàn)或者是腎病綜合征表現(xiàn)，但患者癥狀不典型，病情多變，腎炎表現(xiàn)與腎病表現(xiàn)可互相轉(zhuǎn)變，無一定規(guī)律可循，再加上HBV-GN的發(fā)病機制目前仍不明確，使得HBV-GN的診斷變得復(fù)雜。

有研究表明，循環(huán)免疫復(fù)合物沉積或者腎組織與HBV相關(guān)抗體形成原位免疫復(fù)合物可能是HBV-GN的發(fā)病機制，而且有學(xué)者用South blot和PCR在腎臟組織中檢測到了HBV環(huán)狀DNA分子(HBV CCCDNA)[17]。HBV CCCDNA是HBV基因組進(jìn)入機體細(xì)胞核后以長鏈為模版，短鏈延長之后形成的；以HBV CCCDNA為轉(zhuǎn)錄模版，再翻譯出包括HBsAg在內(nèi)的各種病毒蛋白。本研究中，HBV-GN組血清HBsAg、血清HBeAg及尿液HBV-DNA的定量和定性檢測高于Non-HBV-GN組，其中以血清HBsAg定量、尿液HBV-DNA的定量和定性檢測差異最為顯著，結(jié)果提示乙型肝炎血清標(biāo)志物對HBV-GN的診斷仍具有重要作用?？紤]到血清HBV-DNA陽性能精確、直接地衡量HBV的復(fù)制，因此，本研究推測患者尿液HBV-DNA陽性及HBsAg檢測對診斷HBV-GN及進(jìn)一步了解該疾病的發(fā)病機制有一定價值。

本研究評估了HBeAg陽性患者的HBsAg定量與尿液HBV-DNA拷貝水平的相關(guān)性(r=0.718,P<0.05)，而HBeAg陰性患者的HBsAg定量與尿液HBV-DNA拷貝水平的相關(guān)性檢測(r=0.314，P<0.05)，盡管相關(guān)性不如HBeAg陽性患者顯著，但仍能提示HBsAg定量與尿液HBV-DNA拷貝水平具有很高的一致性。本研究結(jié)果與余雪平等[18]的研究結(jié)果相似，但也有學(xué)者報道HBsAg定量與尿液HBV-DNA拷貝水平無明顯相關(guān)性[19]。原因可能是患者處于不同的HBV感染后的疾病分期，機體內(nèi)HBsAg表達(dá)水平不盡相同，HBV-DNA復(fù)制能力存在差異；也有可能是分組標(biāo)準(zhǔn)和所用試劑的靈敏度不同所致。

ROC分析3種診斷方式的效能，結(jié)果顯示HBsAg定量檢測的靈敏度為0.58，特異度為0.59;尿液中HBV-DNA檢驗的靈敏度為0.64，特異度為0.63;聯(lián)合檢測靈敏度為0.79，特異度為0.78，聯(lián)合檢測顯著優(yōu)于單一檢測，原因可能是HBV-DNA某些區(qū)段存在突變。本研究中僅檢測了腎組織的HBsAg，而HBV感染人體后形成的循環(huán)免疫復(fù)合物包括了HBsAg、HBeAg及HBV核心抗原(HBcAg)的抗原抗體復(fù)合物，相對分子質(zhì)量較低的HBeAg免疫復(fù)合物能經(jīng)腎小球濾過并沉積在內(nèi)皮下，使得HBsAg定量診斷HBV-GN的假陰性增高；也有可能是病理診斷標(biāo)準(zhǔn)是1989年我國學(xué)者制訂的HBV-GN診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中腎組織中檢測到HBV抗原是基本條件，但是最近有研究稱HBV沉積與病變并無直接關(guān)系，免疫復(fù)合物的沉積才是密切相關(guān)的，而HBV抗原沉積在腎小球后不一定引起異常免疫反應(yīng)并產(chǎn)生大量免疫復(fù)合物沉積，因而參照此診斷標(biāo)準(zhǔn)會使陽性率升高[17]。因此，研究結(jié)果盡管提示聯(lián)合檢測診斷HBV-GN的靈敏度和特異度均未達(dá)到90.0%，但仍可以考慮將HBsAg定量聯(lián)合尿液HBV-DNA檢測作為HBV-GN的診斷的重要參考。而且筆者考慮為了有效降低診斷的假陰性及假陽性，可在后續(xù)的研究中分析尿液HBV-DNA、HBsAg定量、HBeAg定量等多個指標(biāo)的相關(guān)性并探索其聯(lián)合檢測的診斷效能。

綜上所述，HBsAg定量與尿液HBV-DNA拷貝水平有很好的一致性，二者的檢驗信息可以互補，HBsAg定量與尿液HBV-DNA聯(lián)合檢測的結(jié)果可作為HBV-GN診斷的重要參考。