劉會(huì)，張曙影，袁國軍，榮季冬

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致動(dòng)脈缺血性疾病的主要原因，平滑肌細(xì)胞增殖是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。賴氨酰氧化酶（LOX）是一種依賴銅的氨基酸氧化酶，參與細(xì)胞分化、遷移、轉(zhuǎn)型與基因表達(dá)調(diào)控[1]。LOX表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[2,3]。高尿酸血癥是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增加，并介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增生[4]。Gacheru等[5]發(fā)現(xiàn)，刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖可上調(diào)LOX表達(dá)。因此，我們推測(cè)尿酸可能上調(diào)VSMC中LOX的表達(dá)。為驗(yàn)證這一假說，我們體外培養(yǎng)大鼠VSMC，研究尿酸對(duì)大鼠VSMC 中LOX及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)試劑及耗材：大鼠VSMC來自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、尿酸、β氨基丙腈（BAPN）、二甲基亞砜（DMSO）、溴化乙錠（Sigma公司，美國）；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液（HyClone公司，北京）；胎牛血清、0.25%胰酶-0.03 EDTA細(xì)胞消化液（Gibco公司，美國）；活性氧測(cè)定盒（碧云天公司，廣州）；磷酸鹽緩沖液（PBS，HyClone，北京）；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning，美國）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒、RNAiso Plus、DL1000 DNA marker、瓊脂糖（寶生物工程有限公司，大連）；免疫印跡及凝膠電泳試劑、細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（凱基生物有限公司，南京）；羊抗人LOX多克隆抗體（Santa Cruz公司，北京）；辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的二級(jí)抗體、鼠抗MMP-2、鼠抗β-肌動(dòng)蛋白（中杉金橋生物有限公司，北京）；Millipore 超濾離心管（Millipore公司，上海）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）化學(xué)發(fā)光試劑盒（碩嘉生物科技公司，上海）。

大鼠VSMC培養(yǎng)：液氮凍存的細(xì)胞株用 37℃水浴溶解后用含 10%胎牛血清的DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液洗去凍存液，接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶，于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)液，以后每 2 d 換液，生長融合達(dá) 80%左右時(shí)進(jìn)

行傳代培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組及預(yù)處理：本實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組（只加新鮮的DMEM/F12 培養(yǎng)基）；尿酸組（20、40、60 mg/L尿酸干預(yù)48 h；40 mg/L尿酸干預(yù)24、48、72 h）；β氨基丙腈組（40 mg/L尿酸干預(yù)48 h后加入LOX的特異性抑制劑β氨基丙腈 10 mg/ml孵育 24 h）。

細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：用倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖量：MTT法測(cè)得的光密度值可間接反應(yīng)細(xì)胞增殖量。參照榮季冬等[6]提出的方法，將狀態(tài)良好的大鼠VSMC按（2.0±0.2）×105/ml密度接種到96孔培養(yǎng)板中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基（不含血清），孵育4 h后吸棄培養(yǎng)基，于不同孔中分別加入終濃度為 20、40、60 mg/L的尿酸 200 μl，孵育48 h；或在不同孔中加入終濃度為40 mg/L 尿酸 200 μl，分別孵育 24、48、72 h，加入 MTT 溶液，避光孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，酶標(biāo)儀（490 nm波長）測(cè)定各孔光密度值。

細(xì)胞活性氧測(cè)定：將狀態(tài)良好的大鼠VSMC按5×104/ml～10×104/ml密度接種于 96孔板中，孵育6 h后吸棄DMEM培養(yǎng)基，于不同孔中分別加入終濃度 20、40、60 mg/L 的尿酸 100 μl，孵育 48 h，吸棄培養(yǎng)液后加入終濃度為10 μmol/L的熒光探針2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA） 100 μl，37℃孵育20 min，DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察活性氧情況[7]，最大激發(fā)及發(fā)射波長分別是488 nm和525 nm。

RT-PCR：濃度為40 mg/L尿酸干預(yù)48 h后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，收集大鼠VSMC并提取其總RNA，計(jì)算總RNA的濃度和純度。取1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法合成cDNA，產(chǎn)物按PCR試劑盒說明書方法操作。所有引物均參造Genebank提供的序列，由大連晨鈺生物有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，經(jīng)過多個(gè)（表1）循環(huán)（95℃變性25 s，復(fù)性 48℃ ～63℃ 35 s，72℃ 延伸 65 s），終末 72℃延伸 5 min 。PCR產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，以Bio-Image圖像采集和分析軟件分析各條帶的光密度值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參（β-肌動(dòng)蛋白）的光密度比值，以此作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所用引物信息

免疫印跡法檢測(cè)：吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，加蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，期間反復(fù)震蕩混勻，離心后取上清 BCA 法蛋白定量。取50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白及轉(zhuǎn)膜，15%脫脂牛奶-PBST溶液室溫下封閉60 min，加入一級(jí)抗體（β-肌動(dòng)蛋白：鼠抗單克隆抗體為1:2 000；LOX：羊抗人多克隆抗體為 1:500；MMP-2：鼠抗單克隆抗體為1:500），4℃搖床上過夜，PBST洗膜10 min，洗5次，加入HRP偶聯(lián)二級(jí)抗體（β-肌動(dòng)蛋白：山羊抗小鼠為1:20 000；LOX：兔抗羊?yàn)?:2 000；MMP-2：山羊抗小鼠為1:2 000），室溫下?lián)u床上孵育60 min，PBST洗膜10 min，洗5次，ECL法發(fā)光顯像，X線壓片曝光，將曝光膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶像素灰度值。用目標(biāo)蛋白的灰度值比β-肌動(dòng)蛋白的灰度值為數(shù)值，所得數(shù)值代表目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，組間資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

體外培養(yǎng)的大鼠VSMC形態(tài)：倒置顯微鏡顯示，培養(yǎng)的大鼠VSMC呈典型谷峰樣生長，為大鼠VSMC特異的生長方式。

不同濃度尿酸干預(yù)48 h對(duì)大鼠VSMC增殖的影響（表2）：與對(duì)照組比較，尿酸組不同濃度尿酸干預(yù)大鼠VSMC 48 h后細(xì)胞增殖量均明顯增加，且細(xì)胞增殖量隨著尿酸濃度升高而增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

表2 對(duì)照組和尿酸組不同濃度尿酸干預(yù)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖情況比較(n=5,±s）

表2 對(duì)照組和尿酸組不同濃度尿酸干預(yù)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖情況比較(n=5,±s）

注：與對(duì)照組比較*P＜0.01；與尿酸組(20 mg/L尿酸干預(yù))比較△P＜0.01；與尿酸組(40 mg/L尿酸干預(yù))比較▲P＜0.01

組別 光密度值(490 nm)對(duì)照組 0.358±0.018尿酸組(干預(yù)48 h)20 mg/L尿酸干預(yù) 0.549±0.036*40 mg/L尿酸干預(yù) 0.645±0.019*△60 mg/L尿酸干預(yù) 0.770±0.023*△▲F值 245.523

不同濃度尿酸干預(yù)48 h對(duì)大鼠VSMC活性氧的影響（圖1、表3）：與對(duì)照組相比，不同濃度尿酸干預(yù)大鼠VSMC 48 h后細(xì)胞活性氧均明顯增多, 且活性氧含量隨著尿酸濃度升高而增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下對(duì)照組和尿酸組不同濃度尿酸干預(yù)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞活性氧生成情況（n=5,×10）

表3 對(duì)照組和尿酸組不同濃度尿酸干預(yù)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞活性氧的平均熒光強(qiáng)度比較(n=5,±s）

表3 對(duì)照組和尿酸組不同濃度尿酸干預(yù)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞活性氧的平均熒光強(qiáng)度比較(n=5,±s）

注：與對(duì)照組比較*P＜0.01；與尿酸組(20 mg/L尿酸干預(yù))比較△P＜0.01；與尿酸組(40 mg/L尿酸干預(yù))比較▲P＜0.01

組別 平均熒光強(qiáng)度對(duì)照組 2.41±0.47尿酸組(干預(yù)48 h)20 mg/L尿酸干預(yù) 4.35±0.26*40 mg/L尿酸干預(yù) 12.46±2.26*△60 mg/L 尿酸干預(yù) 22.96±4.07*△▲

40 mg/L尿酸干預(yù)不同時(shí)間對(duì)大鼠VSMC增殖的影響（表4）：對(duì)照組及尿酸組40 mg/L尿酸干預(yù)下，大鼠VSMC增殖量隨孵育時(shí)間延長均有所增加；在孵育時(shí)間相同的情況下，尿酸組40 mg/L尿酸干預(yù)下大鼠VSMC增殖量較對(duì)照組均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

表4 對(duì)照組和尿酸組40 mg/L尿酸干預(yù)不同時(shí)間后大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖情況比較(n=5,±s）

40 mg/L尿酸干預(yù) 48 h對(duì)大鼠VSMC中LOX和MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（圖2、圖3、表5）：與對(duì)照組比較，尿酸組（40 mg/L尿酸干預(yù) 48 h）大鼠VSMC中LOX、MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯增加（P均＜0.01）；與尿酸組（40 mg/L尿酸干預(yù) 48 h）比較，β氨基丙腈組大鼠VSMC中LOX、MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯下降（P均＜0.01）。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物電泳顯示三組大鼠VSMC中LOX和MMP-2 信使核糖核酸的表達(dá)情況

圖3 免疫印跡法顯示三組大鼠VSMC中LOX和MMP-2蛋白的表達(dá)情況

表5 半定量分析三組大鼠VSMC中LOX、MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響(n=5,±s）

表5 半定量分析三組大鼠VSMC中LOX、MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響(n=5,±s）

注：VSMC：血管平滑肌細(xì)胞；LOX：賴氨酰氧化酶；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶-2；mRNA：信使核糖核酸。*：指40 mg/L尿酸干預(yù) 48 h的情況下。與對(duì)照組比較△P＜0.01；與尿酸組比較▲P＜0.01

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是人類心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，因此，防治動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)于減少心血管疾病負(fù)擔(dān)非常關(guān)鍵。目前公認(rèn)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理是：內(nèi)皮細(xì)胞受損后其功能及滲透性發(fā)生改變，脂質(zhì)和單核細(xì)胞沉積于內(nèi)皮下形成脂質(zhì)斑，附著于損傷處的血小板釋放生長因子刺激平滑肌細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜、增殖合成膠原纖維，最終纖維斑塊形成。因此，平滑肌細(xì)胞增殖是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵步驟。

自Gertler等[8]首次報(bào)道尿酸與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病相關(guān)后，眾多的臨床研究證實(shí)，血尿酸增高與心血管疾病密切相關(guān)[9]，并且認(rèn)為高尿酸血癥是心血管疾病的危險(xiǎn)因素[10,11]。但高尿酸血癥與心血管疾病之間如何關(guān)聯(lián)目前尚不明確。本研究結(jié)果顯示，不同濃度尿酸（20、40、60 mg/L）干預(yù)大鼠VSMC 48 h及40 mg/L尿酸干預(yù)不同時(shí)間（24、48、72 h）后，細(xì)胞增殖量均增加，且呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。大鼠VSMC在不同濃度尿酸（20、40、60 mg/L）干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)活性氧生成量增加，且呈濃度依賴性，這印證了尿酸可通過一系列途徑使氧自由基增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重。

LOX在動(dòng)脈粥樣硬化過程中扮演著重要的作用，LOX的調(diào)節(jié)變化在動(dòng)脈粥樣硬化早、晚期可能有所不同，在動(dòng)脈粥樣斑塊形成及破裂過程中，均發(fā)現(xiàn)有LOX表達(dá)異常[12]。既往我們的研究表明，LOX在心臟重構(gòu)中扮演重要作用，提取慢性心力衰竭小鼠心肌組織的RNA及蛋白質(zhì)，LOX可通過p38及核因子-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)心臟重構(gòu)[13]。此外，刺激成年大鼠VSMC增殖可促進(jìn)LOX的表達(dá)[14]。既往有研究表明，尿酸可刺激大鼠VSMC增殖[15]，但尿酸誘導(dǎo)VSMC增殖后是否能調(diào)節(jié)LOX表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展則未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，尿酸誘導(dǎo)VSMC增殖后LOX的表達(dá)上調(diào)，這與Gacheru等[5]的報(bào)道相似，這證實(shí)尿酸可上調(diào)大鼠VSMC中LOX的表達(dá)進(jìn)而在一定程度上促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

MMP是一組鋅、鈣離子依賴的蛋白水解酶家族，特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合并降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與炎性反應(yīng)、缺血缺氧損傷、心血管疾病和癌癥等病理過程[16,17]。姜昕等[18]報(bào)道，在正常動(dòng)脈組織中沒有檢測(cè)到MMP活性，而在動(dòng)脈粥樣硬化血管中，隨著血管動(dòng)脈粥樣硬化程度加重，MMP的表達(dá)量升高。此外有研究表明，心肌梗死動(dòng)物模型心肌組織中LOX的表達(dá)明顯上調(diào)，心肌組織膠原纖維明顯增加，MMP-1表達(dá)明顯下調(diào)，金屬蛋白酶抑制因子-1表達(dá)無明顯變化[19]。在擴(kuò)張型心肌病中，轉(zhuǎn)化生長因子-β可上調(diào)LOX的表達(dá)，參與促進(jìn)膠原纖維的合成并誘導(dǎo)激活MMP活性[20]，但在VSMC中LOX能否調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展少見報(bào)道。我們推測(cè)，尿酸可通過誘導(dǎo)大鼠VSMC增殖導(dǎo)致LOX表達(dá)增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)，尿酸誘導(dǎo)VSMC增殖后MMP-2表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用LOX的特異性抑制劑β氨基丙腈后，細(xì)胞中的MMP-2表達(dá)明顯下調(diào)，這證實(shí)尿酸誘導(dǎo)VSMC增殖后LOX表達(dá)增加能進(jìn)一步誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)上調(diào)，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，尿酸誘導(dǎo)大鼠VSMC增殖后LOX表達(dá)上調(diào)，LOX可進(jìn)一步上調(diào)MMP-2表達(dá)，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，這可能是尿酸促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的主要機(jī)制之一。但本研究未探索尿酸促進(jìn)LOX表達(dá)的上下游信號(hào)通路，這值得進(jìn)一步研究。