楊 杰，李建達(dá)，曾 昊，任素芳，郭立輝，孫文博，陳 智，叢曉燕，于 江，吳家強(qiáng),3

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100；3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250014）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是一種革蘭氏陰性菌，形態(tài)具有多形性，主要侵害4～8周齡仔豬。由Hps引起的疾病稱為副豬嗜血桿菌病，又稱格拉澤氏病（Gl?sser’s disease），發(fā)病仔豬表現(xiàn)出纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎，甚至腦膜炎等癥狀，發(fā)病率為10%～15%左右，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%[1]。近幾年，Hps引起豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道在我國各地豬場中屢見不鮮，北京市、黑龍江省、遼寧省、山東省、河南省、湖南省、寧夏回族自治區(qū)、湖北省等地均有檢測分離出Hps的報(bào)道，其感染造成的損失相當(dāng)嚴(yán)重[2]。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，Hps已經(jīng)成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要細(xì)菌之一。

Hps的血清型復(fù)雜多樣，可分為15個血清型，另外有20%左右的分離菌株未能進(jìn)行血清學(xué)分型[3]。蔡旭旺等[4]研究表明我國以血清4型和5型最為流行，其次是13型、14型和12型。本實(shí)驗(yàn)室前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)血清1型在我國也較為流行[5]。

目前，Hps的毒力因子主要包括脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、菌毛、莢膜(capsule，CP)、外膜蛋白（outer membrane proteins,Omp）等[6-12]。其中Omp是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，可同時激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，具有異種血清型的免疫交叉保護(hù)作用，是一種潛在的共同保護(hù)性抗原。Mü nch等[13]研究結(jié)果表明，不同血清型菌株抗原性不同，用Hps感染動物產(chǎn)生的抗體針對Omp而不是LPS 和氨甲酰磷酸合成酶（carbamoyl phosphate synthetase，CPS），說明Omp具有很好的免疫原性。也有研究發(fā)現(xiàn)Omp能夠降低Hps在小鼠血液、肝臟和肺臟中的定植及其引起的病理損傷[14]。Tadjine等[15]報(bào)道Hps的15個血清型均與1個主要的外膜蛋白反應(yīng)，這個蛋白屬于革蘭陰性菌的Omp家族，表明這個蛋白可能是一個很好的診斷標(biāo)記的候選蛋白。有研究表明重組表達(dá)的OmpP2能與血清5型交叉反應(yīng)[16-17]，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

本實(shí)驗(yàn)室對山東省Hps進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，明確Hps分離株ompP2基因的遺傳演化規(guī)律，成功構(gòu)建Hps OmpP2的原核表達(dá)載體，獲得了OmpP2蛋白高效表達(dá)的工程菌。通過對IPTG誘導(dǎo)濃度、溫度及誘導(dǎo)時間的摸索，確定OmpP2蛋白的最佳表達(dá)條件，并獲得高純度的OmpP2蛋白。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑pEASY-Blunt克隆載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET-30a、表達(dá)菌株BL21、Hps菌、Hps陽性兔血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；TransStartFastPfu DNA Polymerase、感受態(tài)Trans-5α為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；T4 DNA Ligase，限制性內(nèi)切酶Nde I、BamH I、Sph I、Xho I為美國Thermo公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2000、DL5000、Taq酶等購自大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；His標(biāo)簽鼠的單克隆抗體購自艾美捷科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠/羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]，合成Hps特異性鑒定引物。上游引物：5'-GTGATGAGGAAGGGTG GT-3'，下游引物：5'-GGCTTCGTCACCCTCTG T-3'。參考GenBank上發(fā)表的Hps外膜蛋白P2序列（FJ685754.1）設(shè)計(jì)1對引物，在上游引物的5'端加入Nde I酶切位點(diǎn)，下游引物5'端加入BamH I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增ompP2基因。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物P1：5'-CGCCA TATGATGAAAAAAACACTAGTAGCATTAGC-3'（斜體代表Nde I酶切位點(diǎn)），下游引物P2：5'-CCG GGATCCTTACCATAATACACGTAAACCAACA-3'（斜體代表BamH I酶切位點(diǎn)）。

1.3 Hps分子流行病學(xué)調(diào)查2015年和2016年從山東省多個地區(qū)的豬場，無菌采集疑似病料共225份（包括發(fā)病豬、病死豬或發(fā)病豬的血液、肺臟、心包液、腦、關(guān)節(jié)液），劃線接種于含10 mg/mLNAD和5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～72 h，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，挑取疑似菌落進(jìn)行Hps PCR擴(kuò)增[5]。

1.4 ompP2基因的擴(kuò)增及遺傳演化分析將PCR鑒定陽性的Hps，采用直接煮沸法從Hps培養(yǎng)液中提取DNA，PCR反應(yīng)體系50 μL：10×Buffer10 μL，2.5×dNTP 5 μL(2.5 μmol/L)，10 μmol/L引物P1、P2各2 μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase 1 μL，DNA模板2 μL，去離子水28 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸90 s，32個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，純化回收，與pEASY-Blunt載體連接，并轉(zhuǎn)化Trans-5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

對17株Hps 分離株與NCBI中公布的SW124 OmpP2序列（HM172009.1）以及Hps 血清5型分離株LZ株，用DNASTAR軟件進(jìn)行氨基酸同源性比對及遺傳進(jìn)化樹分析。

1.5 同源性蛋白的交叉反應(yīng)性分析選取與Hps血清5型分離株LZ株同源性較近的兩株分離株5和WFZC，感染豬肺泡巨噬細(xì)胞8 h，以LZ株陽性兔血清作為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體作為二抗，熒光顯微鏡觀察結(jié)果，以確定具有一定同源性蛋白的交叉反應(yīng)性。

1.6 ompP2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將測序正確的Hps 血清5型LZ株的ompP2重組質(zhì)粒pEASY-ompP2和pET-30a原核表達(dá)載體，分別用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamHI進(jìn)行雙酶切，純化回收，連接后轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株，挑取單克隆進(jìn)行Sph I和Xho I雙酶切鑒定，并將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.7 OmpP2蛋白的表達(dá)與純化待菌液培養(yǎng)至OD600為0.8時，加入IPTG（終濃度0.25 mmol/L），分別于15℃、37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎至菌液清亮，取超聲后的上清和沉淀分別上樣。分別用50、100、500 mmol/L濃度的咪唑平衡緩沖液洗脫目的蛋白，并收集每個洗脫組分，進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測。

1.8 OmpP2純化蛋白的鑒定純化后的OmpP2蛋白用His標(biāo)簽鼠的單克隆抗體作為一抗，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗進(jìn)行Western blot鑒定，顯色，觀察條帶。

1.9 OmpP2蛋白的反應(yīng)原性分析純化后的OmpP2蛋白電泳后，轉(zhuǎn)印到NC膜上，用血清2型、4型、5型、13型、15型陽性兔血清作為一抗，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體作為二抗，顯色，觀察條帶，以確定純化的OmpP2蛋白與不同血清型Hps 陽性血清之間的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果

2.1 Hps的分離鑒定225份樣品中共分離獲得17株Hps 分離株，在含10 mg/mL NAD和5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上生長出圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠狀小菌落（圖1），PCR擴(kuò)增獲得長度為822 bp的目的條帶。2015年和2016年Hps 的檢出率分別是7.63%、7.48%（表1）。

圖1 Hps分離株革蘭氏染色鏡檢形態(tài)Fig.1 The microscopic observation result of Hps isolates

表1 Hps分離菌株檢出情況Table 1 The detection of Hps isolates from samples

2.2 ompP2基因的擴(kuò)增PCR擴(kuò)增Hps ompP2基因，可獲得大小為1000 bp左右的擴(kuò)增片段，與預(yù)期目的片段大小相符（圖2）。

圖2 Hps ompP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR ampli fication results of Hps ompP2 gene

2.3 序列比對分析用DNASTAR軟件對17株Hps 分離株與NCBI中公布的SW124 OmpP2序列（登錄號：HM172009.1）及Hps 血清5型分離株LZ株進(jìn)行氨基酸序列比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大片段的連續(xù)或不連續(xù)缺失，主要出現(xiàn)在146～170 aa和256～279 aa處（圖3）。

圖3 HpsOmpP2蛋白分離株氨基酸序列比對結(jié)果Fig.3 Amino acid sequence alignment of OmpP2 protein between Hps isolates

2.4 同源性分析將PCR檢測為陽性的17株Hps分離株與NCBI中公布的SW124 OmpP2序列（HM172009.1）及Hps 血清5型分離株LZ株進(jìn)行氨基酸同源性比對，結(jié)果見表2。17株山東分離株與SW124的同源性為87.7%～96.1%，與血清5型LZ株的同源性為94.3%～99.1%，而17株山東分離株之間的核苷酸同源性為88.2%～97.8%。

表2 Hps氨基酸序列同源性比較結(jié)果Table 2 Homology comparison of amino acid sequences between Hps isolates

2.5 遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，遺傳進(jìn)化樹主要分為兩個大支，其中13株分離株屬于一個大支，與參考株SW124和LZ株屬于同一支系；而其余4株則屬于另一大支，與參考株SW124和LZ株親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)（圖4）。

圖4 ompP2基因遺傳進(jìn)化樹Fig.4 The genetic phylogenetic tree of ompP2 gene

2.6 同源性蛋白的交叉反應(yīng)性分析用Hps 血清5型LZ株陽性兔血清作為一抗進(jìn)行免疫熒光，分離株5和WFZC均有綠色熒光出現(xiàn)，而未用Hps 感染的細(xì)胞無綠色熒光出現(xiàn)，說明同源性蛋白具有一定的交叉反應(yīng)性（圖5）。

圖5 免疫熒光檢測結(jié)果Fig.5 The result of immuno fl uorescence assay

2.7 原核表達(dá)載體pET-30-ompP2的酶切鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)Nde I和Hind III雙酶切鑒定，結(jié)果可見酶切后呈兩條帶（圖6），陽性樣品送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，將測序成功的質(zhì)粒命名為pET-30-ompP2。

圖6 重組質(zhì)粒pET-30a-ompP2酶切鑒定結(jié)果Fig.6 Identi fication of recombinant plasmid pET-30aompp2 by enzyme digestion

2.8 OmpP2蛋白最佳誘導(dǎo)條件的確定將菌液分別置于15℃、37℃誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)37℃誘導(dǎo)4 h，OmpP2蛋白表達(dá)效果更好，目的條帶大小為39 kDa（圖7）。因此，OmpP2蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度確定為37℃。

圖7 OmpP2蛋白最佳誘導(dǎo)溫度的確定Fig.7 Determination of optimal induction temperature for OmpP2 protein

2.9 OmpP2蛋白的包涵體表達(dá)及純化超聲后沉淀中OmpP2蛋白的表達(dá)量很高（圖8），說明該蛋白是包涵體表達(dá)。用50 mmol/L和100 mmol/L濃度的咪唑洗脫效果比500 mmol/L濃度的咪唑洗脫效果好（圖9）。

圖8 OmpP2蛋白SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis of OmpP2 protein

圖9 OmpP2蛋白純化SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of puri fied OmpP2 protein

2.10 OmpP2蛋白的鑒定純化后的OmpP2蛋白在40 kDa左右出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致（圖10）。

2.11 OmpP2蛋白反應(yīng)原性分析Western blot結(jié)果如圖11所示，OmpP2蛋白能夠與血清2型、4型、5型、13型、15型Hps 陽性兔血清發(fā)生反應(yīng)，說明純化的OmpP2蛋白與不同血清型的Hps 陽性血清均存在良好的反應(yīng)原性。

圖10 ompP2基因表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定Fig.10 Western blot identi fication of ompP2 gene expression

圖11 OmpP2蛋白與不同血清型Hps 陽性兔血清Western blot結(jié)果Fig.11 Western blot result of OmpP2 protein with different serotypes of Hps positive rabbit serum

3 討論

副豬嗜血桿菌病是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一，引起該病的病原Hps是寄生于豬呼吸道的常在菌，一旦條件發(fā)生改變就會引起該病的發(fā)生[19]。禤雄標(biāo)等[20]2009～2010年對廣西86份疑似病料進(jìn)行檢測，Hps分離率達(dá)30.2%。周玉龍等[21]對2010年黑龍江省送檢的43份病例進(jìn)行檢測，陽性率達(dá)18.60%。張巖等[22]2012年對新疆石河子墾區(qū)疑似病料105份進(jìn)行檢測，檢出率達(dá)27.62%。于江等[5]2018～2012年對山東省、河南省、河北省、湖南省、江蘇省、上海市等多個豬場送檢的186份疑似樣品進(jìn)行檢測，分離鑒定到57株Hps，分離率達(dá)30.6%，以血清4型和5型最為流行，其次是血清1、12、13型。近幾年，隨著豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等免疫抑制疾病的發(fā)生，Hps繼發(fā)感染的病例越來越多，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對2015～2016年從山東省不同地區(qū)采集的Hps疑似感染樣品進(jìn)行檢測，并對ompP2基因進(jìn)行核苷酸同源性比對和進(jìn)化樹分析。

Hps分為15個血清型，至少有20%無法定型，且不同血清型細(xì)菌之間的交叉保護(hù)能力不確定。已有報(bào)道用全菌裂解抗原[23]或莢膜多糖抗原建立了ELISA檢測方法[24]，但其特異性不強(qiáng)[16]。因此，需要一種反應(yīng)原性和交叉保護(hù)性好的抗原，作為血清學(xué)診斷方法建立和亞單位疫苗制備的基礎(chǔ)。外膜蛋白是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，占其全部組成的1/2[25]，在維持外膜結(jié)構(gòu)和保證物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫婢兄匾饔?。同時細(xì)菌的外膜蛋白也可以產(chǎn)生不同血清型間交叉保護(hù)性[26]。研究人員通過攻毒后保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)Omp具有一定的保護(hù)作用[27]?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定出15個新的有免疫原性的外膜蛋白，其中有4種（PalA、OmpP2、D15和Hps 06257）被證明具有作為疫苗候選蛋白的潛力[28]。Hps中存在TbpA和TbpB兩種轉(zhuǎn)鐵蛋白。李建軍等[29]建立了TbpA基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，證明TbpA蛋白具有良好免疫原性。朱小寧等[30]構(gòu)建了D15基因的原核表達(dá)載體，證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物能被Hps陽性血清識別，具有反應(yīng)原性。

本研究對Hps血清5型分離株LZ株的ompP2基因進(jìn)行剪接和修飾，確定最佳誘導(dǎo)溫度，獲得了高效表達(dá)的OmpP2蛋白，通過Western blot方法確定該蛋白與不同血清型Hps陽性血清之間均存在特異性反應(yīng)，因此推測可以用ompP2基因的表達(dá)產(chǎn)物建立ELISA診斷方法，以檢測Hps 的血清抗體水平，也為今后研究Hps OmpP2的生物學(xué)特性及對Hps的血清學(xué)診斷、亞單位疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。