王金安，周 葉，宋開(kāi)放，劉長(zhǎng)忠，劉俊偉，姜金慶

（1. 河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng)453003；2. 淇縣職業(yè)中等專(zhuān)業(yè)學(xué)校，鶴壁 456750）

結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)?。˙alantidiosis）是由結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)（Balantidium coli）引起的人畜共患寄生蟲(chóng)病，呈全球性分布，已報(bào)道豬、牛、羊以及爬行類(lèi)等50多種動(dòng)物均可感染該病[1-3]。中國(guó)生物醫(yī)學(xué)研究中心檢測(cè)到靈長(zhǎng)類(lèi)食蟹猴結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)感染率達(dá)到22.2%[4]，巴西學(xué)者在圈養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物糞便中檢測(cè)到高達(dá)56.7%的結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)感染率[5]。結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)可致痢疾樣腹瀉及腸道外感染，或者與其他病原體合并感染，甚至引起腸壞死等癥狀，嚴(yán)重威脅人畜安全[6]。結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育分為兩個(gè)階段，即滋養(yǎng)體期和包囊期[7]，在寄生蟲(chóng)處于滋養(yǎng)體時(shí)期進(jìn)行殺滅可達(dá)到最佳效果。羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)病是由結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)寄生于羊的大腸內(nèi)引起的以腹瀉、脫水、消瘦和貧血為特征的人獸共患原蟲(chóng)病。豬結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)的研究報(bào)道較多，例如，纖毛蟲(chóng)的體外培養(yǎng)試驗(yàn)[8]、豬結(jié)腸袋蟲(chóng)的分子鑒定[9]、藥物毒殺試驗(yàn)[10]和理化因素影響試驗(yàn)[11]等，而有關(guān)羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)的病例分析目前少見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)進(jìn)行了培養(yǎng)，并探討各種消毒劑體外殺滅羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的效果。

1 材料和方法

1.1 羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)的采集與處理羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)采自河南省新鄉(xiāng)市某杜泊綿羊養(yǎng)殖戶(hù)。該養(yǎng)殖戶(hù)共飼養(yǎng)100只羊，放牧散養(yǎng)，其中30只患嚴(yán)重腹瀉，糞便直接鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體。將陽(yáng)性糞便接種于改良型RSS培養(yǎng)基，28℃進(jìn)行增殖，達(dá)到繁殖期時(shí)，用培養(yǎng)基將滋養(yǎng)體稀釋至約3×104個(gè)/mL，制成羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液備用。

1.2 改良型RSS培養(yǎng)基氯化鈉8 g、氯化鉀0.2 g、磷酸氫二鈉2 g、磷酸二氫鉀0.3 g溶解于滅菌蒸餾水1000 mL，使用前加入氯化鈣0.2 g、氯化鎂0.01 g，混勻備用，配制成洛克氏液（Ringer液）。適量Ringer液中，加入25%的胎牛血清，1.5%玉米淀粉和10000 U/mL的青霉素、鏈霉素，調(diào)節(jié)pH值至7.0，配制成改良型RSS培養(yǎng)基[11]，用于羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.3 消毒劑 10%高錳酸鉀溶液、5%NaOH溶液、10%硫酸銅溶液、5%戊二醛和5%福爾馬林按標(biāo)準(zhǔn)方法配制成消毒劑母液；6%84消毒液、23%過(guò)氧乙酸、新潔爾滅（5%苯扎溴銨液）、5%聚維酮碘液和來(lái)蘇兒（2.8%甲酚皂溶液）直接購(gòu)買(mǎi)自正規(guī)生產(chǎn)廠家。

1.4 絕對(duì)致死濃度（lethal concentration，LC100）在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入改良型RSS培養(yǎng)基至第12孔，每孔100 μL；10%高錳酸鉀溶液100 μL，吹吸混勻后吸取100 μL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，從第11孔棄去100 μL，留第12孔作陰性對(duì)照；每孔分別加入羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液100 μL，輕輕震蕩細(xì)胞培養(yǎng)板，使各孔混勻，蓋上蓋板膜，28℃培養(yǎng)箱中作用6 h，置顯微鏡下觀察羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的存活情況。本組試驗(yàn)作3個(gè)重復(fù)。將10%高錳酸鉀溶液致羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體全部死亡的最大稀釋倍數(shù)（最小濃度），計(jì)作高錳酸鉀溶液的絕對(duì)致死濃度（LC100）。

用5%NaOH溶液、10%硫酸銅溶液、5%戊二醛、5%福爾馬林、6%84消毒液、23%過(guò)氧乙酸、5%新潔爾滅、5%聚維酮碘液和2.8%來(lái)蘇兒分別重復(fù)上述試驗(yàn)。根據(jù)LC100數(shù)值選取殺菌效果最好的3種消毒劑，確定下一步試驗(yàn)濃度梯度，并測(cè)算其半數(shù)致死濃度（LC50）。

1.5 半數(shù)致死濃度（LC50）試驗(yàn)

1.5.1 高錳酸鉀2 h和12 h毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以10%高錳酸鉀溶液為母液，使用改良型RSS培養(yǎng)基對(duì)高錳酸鉀溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)罱K選取9個(gè)濃度梯度：0、12×10-4、14×10-4、16×10-4、18×10-4、20×10-4、22×10-4、24×10-4和12×10-4。將培養(yǎng)的羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液混合均勻，分別加入27個(gè)10 mL容量青霉素瓶?jī)?nèi)，并補(bǔ)充培養(yǎng)基使每瓶液體體積為3 mL，然后分成9組，每組3個(gè)平行。將不同濃度的高錳酸鉀稀釋液加入相應(yīng)組別的青霉素瓶?jī)?nèi)，每瓶3 mL，高錳酸鉀最終濃度（稀釋倍數(shù)）分別為：0、6×10-4、7×10-4、8×10-4、9×10-4、10×10-4、11×10-4、12×10-4和13×10-4。將青霉素瓶加蓋后置28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，2 h后取出，液體充分混勻，移液器吸取10 μL滴于載玻片上，加蓋玻片后顯微鏡檢。12 h毒性試驗(yàn)時(shí)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，高錳酸鉀最終濃度確定為：0、20×10-6、30×10-6、40×10-6、50×10-6、60×10-6、70×10-6、80×10-6和90×10-6，其他步驟同2 h毒性試驗(yàn)。

1.5.2 福爾馬林2 h和12 h毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用改良型RSS培養(yǎng)基將福爾馬林母液稀釋后用于毒性試驗(yàn)，具體分組和觀察方法同1.5.1。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定2 h毒性試驗(yàn)中福爾馬林最終濃度分別為：0、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4、6×10-4、7×10-4、8×10-4和9×10-4，12 h毒性試驗(yàn)中福爾馬林最終濃度分別為：0、40×10-6、50×10-6、60×10-6、70×10-6、80×10-6、90×10-6、100×10-6和110×10-6，其他步驟同高錳酸鉀毒性試驗(yàn)。

1.5.3 NaOH 2 h和12 h毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用改良型RSS培養(yǎng)基將NaOH母液稀釋后用于毒性試驗(yàn)，具體分組和觀察方法同1.5.1。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定2 h毒性試驗(yàn)中NaOH的最終濃度分別為：0、8×10-4、9×10-4、10×10-4、11×10-4、12×10-4、13×10-4、14×10-4和15 ×10-4，12 h毒性試驗(yàn)的最終濃度分別為0、60×10-6、70×10-6、80×10-6、90×10-6、100×10-6、110×10-6、120×10-6和130×10-6，其他步驟同高錳酸鉀毒性試驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)計(jì)算

1.6.1 滋養(yǎng)體存活性判定 將載玻片置顯微鏡100倍暗視野下檢查，計(jì)算30個(gè)視野下樣品的蟲(chóng)體平均密度。蟲(chóng)體運(yùn)動(dòng)減弱，原地緩慢旋轉(zhuǎn)、纖毛小幅度擺動(dòng)者仍作活蟲(chóng)計(jì)數(shù)；蟲(chóng)體不運(yùn)動(dòng)，表膜脫出、萎縮、裂解或結(jié)構(gòu)破碎者，作死蟲(chóng)計(jì)數(shù)。

1.6.2 死亡率 以對(duì)照組（消毒劑濃度為0）3個(gè)平行樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所獲得的平均活蟲(chóng)數(shù)為X，以該試驗(yàn)系列相應(yīng)濃度組3個(gè)平行樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所獲得的平均活蟲(chóng)數(shù)為Y，將（X—Y）/X的數(shù)值換算成百分?jǐn)?shù)，就是該濃度條件下的羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的死亡率。

1.6.3 半數(shù)致死濃度（LC50）的計(jì)算 采用機(jī)率單位法計(jì)算LC50值，根據(jù)死亡百分率—機(jī)率單位換算表，將不同濃度下死亡百分率換算成死亡機(jī)率單位[10]。以橫軸表示濃度對(duì)數(shù)，以縱軸表示死亡機(jī)率單位，作XY散點(diǎn)圖，順著所獲得的散點(diǎn)作一趨勢(shì)線，并自動(dòng)獲得該直線的回歸方程。經(jīng)x2檢驗(yàn)回歸線符合要求后，利用該方程式求出死亡機(jī)率單位5（50%死亡率）時(shí)的藥物濃度對(duì)數(shù)，查反對(duì)數(shù)表就可以獲得LC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)消毒劑的敏感性試驗(yàn)結(jié)果羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)消毒劑的敏感性結(jié)果見(jiàn)表1。高錳酸鉀、福爾馬林、NaOH、戊二醛、硫酸銅、過(guò)氧乙酸、聚維酮碘、新潔爾滅、來(lái)蘇兒和84消毒液對(duì)羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的絕對(duì)致死濃度（LC100，6h）分別為：1:2056、1:1024、1: 1024、1:512、1:256、1:256、1:128、1:128、1:64和1:64，這表明常用消毒劑均可在體外環(huán)境中殺死羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體，其中高錳酸鉀、福爾馬林和NaOH殺蟲(chóng)效果最好。

表1 羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)消毒劑的6 h敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Sensitivity test results of the disinfectants on trophozoite of sheep Balantidium coli

將消毒劑放在平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤氲攘颗囵B(yǎng)的結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液，28℃作用6 h，顯微鏡下觀察結(jié)果，測(cè)定消毒劑對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的絕對(duì)致死濃度（LC100），該方法簡(jiǎn)便、快捷、直觀和實(shí)用。臨床上也可直接將新鮮糞便加液體培養(yǎng)基攪勻，糞網(wǎng)篩過(guò)濾，必要時(shí)進(jìn)行離心濃集滋養(yǎng)體，制成結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液進(jìn)行試驗(yàn)，以選出高效消毒劑，指導(dǎo)獸醫(yī)臨床進(jìn)行環(huán)境消毒和疫病防控。

2.2 高錳酸鉀毒性試驗(yàn)結(jié)果2 h毒性試驗(yàn)的的回歸方程式為Y=3.477X-5.191，R2=0.984，回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.931，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為853.1×10-6，即8.531×10-4，見(jiàn)圖1A；12 h毒性試驗(yàn)的的回歸方程式為Y=1.184X+3.187，R2=0.991，回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為1.813，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為65.02×10-6，即6.502×10-5（圖1B）。本研究參考豬結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)毒性試驗(yàn)方法[12]，建立了針對(duì)羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體體外消毒劑半數(shù)致死濃度（LC50）的測(cè)定方法。結(jié)果顯示，高錳酸鉀的2 h半數(shù)致死濃度（LC50）為8.531×10-4，12 h半數(shù)致死濃度（LC50）分別為6.502×10-5。12 h半數(shù)致死濃度數(shù)據(jù)顯示中高錳酸鉀效果最好。高錳酸鉀通過(guò)氧化蟲(chóng)體的活性基因而發(fā)揮殺滅作用，其突出特點(diǎn)是無(wú)異味，價(jià)格低廉，無(wú)毒副作用且使用方便，故可作為料槽、水槽、動(dòng)物體表消毒的首選。

圖1 高錳酸鉀的濃度對(duì)數(shù)-羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體死亡機(jī)率單位曲線Fig.1 The relationship of potassium permanganate logarithm concentration-Balantidium coli trophozoite death probability unit curve

2.3 福爾馬林毒性試驗(yàn)結(jié)果福爾馬林2 h毒性試驗(yàn)的的回歸方程式為Y=2.882X-2.561，R2=0.988，回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.624，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為421.3×10-6，即4.213×10-4，見(jiàn)圖2A；12 h毒性試驗(yàn)的的回歸方程式為Y=1.815X+1.521，R2=0.993，回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為1.917，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為82.67×10-6，即8.267×10-5，見(jiàn)圖2B。結(jié)果顯示，福爾馬林的2 h半數(shù)致死濃度（LC50,2h）為4.213×10-4，12 h半數(shù)致死濃度（LC50,12h）為8.267×10-5，即2 h半數(shù)致死消毒劑中福爾馬林效果最好。福爾馬林有強(qiáng)烈的刺鼻性氣味，但其2h半數(shù)致死濃度較低，因此進(jìn)行體外消毒，不會(huì)對(duì)人和動(dòng)物造成很大傷害。

圖2 福爾馬林的濃度對(duì)數(shù)-羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體死亡機(jī)率單位曲線Fig.2 The relationship of formalin logarithm concentration- Balantidium coli trophozoite death probability unit curve

2.4 NaOH 2 h和12 h毒性試驗(yàn)結(jié)果NaOH的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位呈線性關(guān)系（圖5）。2 h毒性試驗(yàn)的的回歸方程式為Y≒6.789X-15.51，R2≒0.990，回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為3.021，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為1050×10-6，即10.50×10-4。12h毒性試驗(yàn)的的回歸方程式為Y=2.357X+0.255，R2=0.992，其回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.013，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為103.1×10-6，即10.31×10-5。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，NaOH的2 h半數(shù)致死濃度（LC50,2h）為10.50×10-4，12 h半數(shù)致死濃度（LC50,12h）為10.31×10-5，NaOH對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)的半數(shù)致死濃度比前兩種消毒劑高一個(gè)數(shù)量級(jí)，但其無(wú)刺激性氣味，可作為空圈舍和潔凈地面的消毒劑。臨床應(yīng)用過(guò)程中，還可以根據(jù)羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的半數(shù)致死濃度，合理選擇消毒劑種類(lèi)、劑量和用藥間隔時(shí)間，以達(dá)到最佳的防控效果。

圖3 NaOH濃度對(duì)數(shù)-羊結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體死亡機(jī)率單位曲線Fig.3 The relationship of NaOH logarithm concentration-Balantidium coli trophozoite death probability unit curve