郭愛民，段成任，楊昆明，謝志勝，焦 麗，馬江霞，岳 城

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

異尖線蟲?。ˋnisakiasis）是由異尖科線蟲第三期幼蟲引起的食源性寄生蟲病，主要病原包括對盲囊線蟲（Contracaccum spp）、宮脂線蟲（Hysterothylacium spp）、簡單異尖線蟲（Anisakis simplex）、抹香鯨異尖線蟲（Anisakis physeteris）、典型異尖線蟲（Anisakis typica）、擬地新線蟲（Pseudoterranova decipiens）[1-2]。魚類感染異尖科線蟲一般表現(xiàn)不明顯，但可影響魚的生長，嚴(yán)重感染時可造成魚體腹部膨脹，異尖線蟲寄生于肝臟時可引起魚體體重下降和器官萎縮。當(dāng)人誤食含有異尖線蟲的生魚片時，會出現(xiàn)腹痛、惡心、嘔吐的癥狀，嚴(yán)重時表現(xiàn)為風(fēng)疹、水腫甚至呼吸障礙、過敏性休克[3-7]。

隨著異尖線蟲對海水魚類感染率的升高，以及鮮食生魚的飲食時尚的興起，全球人類感染異尖線蟲的病例已達(dá)3萬多，并呈上升趨勢[8]，我國也有人體感染異尖線蟲的病例報告[9]。異尖線蟲寄生于海水魚，我國各海域及10多個沿海省市均有異尖線蟲的報道[10-17]。異尖線蟲已列入我國水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的重要病原，異尖線蟲病已列入我國禁止入境的二類動物疫病。

新疆維吾爾自治區(qū)地處歐亞大陸腹地，遠(yuǎn)離海洋，但隨著“一帶一路”的建設(shè)，水產(chǎn)品保存技術(shù)的提高和交通運輸?shù)难杆侔l(fā)展，新疆市場上的海水魚及制品也越來越多。2017年8月我們對新疆烏魯木齊市售海魚進(jìn)行抽樣檢查，發(fā)現(xiàn)5只蟲體疑似異尖線蟲，因此對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2017年8月，從烏魯木齊市各市場及水產(chǎn)超市隨機(jī)購買海魚，帶回實驗室分離組織，檢查有無蟲體和包囊，并詳細(xì)記錄，分離的蟲體洗凈后保存于70%酒精中。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定將蟲體從70%酒精中取出，經(jīng)苯酚-乳酸-甘油透明液透明后制片，在顯微鏡下觀察并拍照測量，參照《異尖線蟲病診斷規(guī)程》[18]進(jìn)行鑒定。

1.3 分子生物學(xué)鑒定將蟲體從70%酒精中取出，置于滅菌的1.5 mL離心管中，超純水復(fù)水3 h后用研磨棒磨碎，根據(jù)Omega軟體動物DNA小量提取試劑盒的步驟提取蟲體基因組DNA。引物為異尖科線蟲ITS序列的通用引物，上游引物：NC5（5'-GAA TTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3'），下游引物：NC2（5'-GCCGGATCCGAATCCTGG TTAGTTTCTTTTCCT-3'），引物由上海生工有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Super mix 25 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、底物2 μL、ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳分析，目的條帶切膠后用OMEGA公司的膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送上海生工生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過BLAST比對，用MEGA 6.0軟件做多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定在冰鮮鱈魚塊中發(fā)現(xiàn)蟲體5只，顯微鏡觀察形態(tài)基本一致。蟲體呈黃白色，體長18～25 mm，體寬0.32～0.41 mm，體表具有明顯的角質(zhì)環(huán)紋，頭部鈍圓（圖1A）；頭部頂端有一鉆齒，鉆齒高10.1～10.8 μm，口近似三角形，周圍有3個略呈梯形的唇片，鉆齒下方可見圓形的排泄孔（圖1C）；食道長1.235～1.437 mm，寬0.075～0.102 mm，前端細(xì)，向后逐漸膨大，神經(jīng)環(huán)呈黑點狀距頭端0.257～0.352 mm；胃呈圓筒形，黑色而不透明；無胃盲囊和腸盲囊，胃與腸以斜線相連（圖1B），腸腔呈“Y”型；尾短，周圍有很多橫紋，頂端有一尾突，呈圓塔形（圖1D），符合異尖線蟲Ⅰ型的典型特征[18]。屬于異尖線蟲Ⅰ型的幼蟲有簡單異尖線蟲、派氏異尖線蟲、典型異尖線蟲和劍吻鯨異尖線蟲（Anisakis ziphidarum）[19]。但由于幼蟲蟲體差異小，在光鏡下只能對線蟲幼蟲鑒定到屬，形態(tài)特征相似的同屬不同種線蟲一般很難用形態(tài)學(xué)方法區(qū)分。

2.2 序列分析樣品測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析比對，本研究所得到的異尖線蟲序列（AN1～5）與GenBank上發(fā)表的簡單異尖線蟲（A. simplex）的序列（登錄號：KY275505.1、KY275506.1、KX550939.1）相似性高達(dá)99%～100%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，AN1～5與GenBank上下載的簡單異尖線蟲（登錄號：KY275505.1、KX550939.1）構(gòu)成一個自展值為 83%的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分支，7個簡單異尖線蟲又與派氏異尖線蟲（A. pegreffii）構(gòu)成一個自展值為 100% 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分支。

圖1 異尖線蟲Ⅰ型3期幼蟲顯微鏡觀察Fig.1 Micrograph of Anisakis typeⅠthird stage larva

圖2 基于核糖體ITS序列的異尖線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Anisakis based on the sequence of ribosomal ITS

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼可為寄生蟲的鑒定提供可靠的數(shù)據(jù)，被稱為分類鑒定和遺傳進(jìn)化分析的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[20]。本研究的序列與韓國報道的鱈魚體內(nèi)的簡單異尖線蟲（GenBank登錄號：KY275505.1）相似度高達(dá)99%，且5個序列與簡單異尖線蟲（GenBank登錄號：KY275505.1、KX550939.1）聚成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)自展值為83%，兩種簡單異尖線蟲又與派氏異尖線蟲聚為一枝，說明在異尖屬線蟲中派氏異尖線蟲和簡單異尖線蟲的遺傳距離最近，這也可能是研究早期把派氏異尖線蟲當(dāng)作簡單異尖線蟲姊妹種的潛在原因[21,22]。同時，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示異尖線蟲Ⅰ型的四種蟲體聚為一枝，并與兩種異尖線蟲Ⅱ型聚為一個更大的分支，這與形態(tài)學(xué)特點相符。

Brier[23]的研究表明異尖線蟲在50℃～55℃、10 s內(nèi)可以死亡，在-20℃冷凍24 h后便可全部死亡。海魚冰鮮保存和運輸?shù)臏囟葹?4℃，異尖線蟲在該溫度可能不會死亡，可隨冰鮮運輸從沿海到達(dá)內(nèi)陸地區(qū)，因此存在擴(kuò)散的風(fēng)險。新疆地處歐亞大陸的中心，離海洋較遠(yuǎn)，以前未見異尖屬線蟲病的報道。這次我們從沿海地區(qū)運輸至烏魯木齊的冰鮮鱈魚塊中發(fā)現(xiàn)了異尖線蟲，說明隨著交通日益發(fā)達(dá)和水產(chǎn)品運輸方式的發(fā)展，存在異尖線蟲被攜帶至遠(yuǎn)離海洋的內(nèi)陸地區(qū)的可能性。

新疆是連通歐亞大陸的重要樞紐，是第二座“亞歐大陸橋”的必經(jīng)之地，是與“一帶一路”沿線國家進(jìn)行貿(mào)易往來的重要門戶。隨著“一帶一路”戰(zhàn)略的實施和瓜達(dá)爾港的建設(shè)，將會有更多來自北冰洋、地中海、印度洋的水產(chǎn)品通過新疆進(jìn)入國內(nèi)市場，這也增加了水產(chǎn)品病原擴(kuò)散的風(fēng)險。而食品安全問題是廣大人民群眾最現(xiàn)實、最直接、最關(guān)心的重大問題，它不僅與消費者的切身利益緊密相連，也與政府形象密切相關(guān)，更是社會和諧和國家長治久安的基礎(chǔ)[24]。

本研究首次在遠(yuǎn)離海洋的烏魯木齊市發(fā)現(xiàn)隨海魚運輸攜帶到新疆的異尖線蟲，需要引起社會各界廣泛關(guān)注。建議檢疫部門加大對水產(chǎn)品的檢疫力度，防治病原擴(kuò)散，為人民的健康保駕護(hù)航。