張燁華，米榮升,2，程 龍，黃 燕,2，賈海燕，張曉麗，游艷敏，韓先干，陳兆國,2

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物產品質量安全生物性危害因子風險評估實驗室（上海） 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

弓形蟲?。╰oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種呈世界性分布人獸共患寄生蟲病，嚴重危害著人類健康[1]。弓形蟲是一種專性細胞內寄生原蟲，既可感染人，也可感染家畜。全世界約三分之一的人為弓形蟲慢性感染者，感染初期的成人通常沒有明顯的癥狀，但孕婦感染后會導致非常嚴重的后果，如早產、流產、死胎及胎兒畸形等。許多畜禽，如豬、牛、貓、犬、羊、馬、兔、雞、鴨等都可以感染弓形蟲并出現(xiàn)癥狀，其中豬的感染率最高，危害也很嚴重。20世紀80年代，弓形蟲病曾在我國豬場大規(guī)模暴發(fā)流行，死亡率高達60% 以上，給養(yǎng)豬生產造成巨大的經濟損失[2]。

在我國，豬肉是人們生活中最主要的動物性食物來源，弓形蟲感染的豬及其肉制品對人類健康構成了極大威脅。若吃了生的或未煮熟的已感染弓形蟲的肉制品，食用者就有可能被感染。因此，了解豬肉中弓形蟲的攜帶狀況，對保障豬肉質量安全具有重要意義。建立簡便、快捷、高效的弓形蟲檢測方法，對于準確了解豬是否感染，豬肉中是否攜帶弓形蟲是十分必要的[3]。

鑒于豬感染弓形蟲后臨床癥狀不明顯、不典型，血清學方法成為較常用的診斷方法，但是該方法不能對豬肉中是否攜帶弓形蟲進行檢測。常規(guī)顯微鏡鏡檢主要針對胸腹腔積液、羊水、腦脊液、骨髓、血液離心沉淀物或組織穿刺物涂片，很容易漏檢。近年來，以PCR為基礎的分子生物學檢測方法因其具有的高敏感性、迅速等優(yōu)點而越來越受到人們的關注[3]。但是不同文獻報道的PCR檢測方法的敏感性差異很大[4-7]。應用分子檢測方法，我國部分地區(qū)開展了豬肉中弓形蟲攜帶情況的調查研究，結果顯示其陽性率在0～18.03%之間。余莉等[5]對合肥市100份豬肉樣品進行PCR檢測，陽性率為17.00%（17/100）。Wang等[8]應用定量PCR檢測了安徽省部分地區(qū)豬肉中弓形蟲攜帶情況，陽性率為18.03%（75/416）。李亞麗等[9]對河南省漯河市市售豬肉進行了檢測，陽性率為4.00%（8/200）。詹婷婷等[10]對重慶、廣州和上海3個城市的豬肉樣品進行了檢測，重慶的陽性率為9.83%（17/173），上海為3.17%（4/126），而廣州則未檢出陽性樣品（0/94）。不同地區(qū)豬肉中弓形蟲的陽性率存在較大差異，可能與采用方法的敏感性有關，也很有可能與提取樣品DNA的質量及效率相關。為尋找高效、穩(wěn)定、快速、經濟的豬肉中弓形蟲DNA提取方法，本試驗將一定數(shù)量的弓形蟲速殖子加入豬膈肌中，用不同試劑盒提取樣品DNA進行PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 蟲株、DNA及豬膈肌樣品弓形蟲PRU株速殖子以及微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）、泰澤隱孢子蟲（C. tyzzeri）、貝氏隱孢子蟲（C. baileyi）、柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）卵囊，以及牛帶絳蟲（Taenia saginata）、日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）和旋毛蟲（Trichinella spiralis）幼蟲由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物源性病原生物學及食品安全創(chuàng)新團隊保存。豬膈肌樣品126份，采自上海市某屠宰場，采集后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及DNA提取試劑盒海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（貨號：DP33）購自上海晶科生物有限公司；EZNA Tissue DNA Kit（貨號：D3396-01）購自OMEGA BIO-TEK公司；GeneJET Genomic DNA Purification Kit（貨號：K0721）購自Thermo Scientific 公司；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 （貨號：9765）購自寶生物工程（大連）有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit（貨號：DP304-03）購自天根生化科技（北京）有限公司；FastDNA Spin Kit for Soil（貨號：116560-200）購自MP公司。TaKaRa Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture為寶生物工程（大連）有限公司產品；DNA Marker DL 2000為北京全式金生物技術有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.3 含不同數(shù)量弓形蟲豬膈肌樣品的制備取經分子檢測為弓形蟲陰性的豬膈肌樣品，用無菌剪刀剪碎，加入適量PBS。樣品用均質儀震蕩破碎，分成5份，每份3.0 g。隨后分別加入6×100、6×101、6×102、6×103、6×104個弓形蟲速殖子，每份樣品加PBS定容至6 mL，混勻后將每個濃度樣品分成6管，每管1 mL，-20℃保存。另取2份豬膈肌樣品，用同樣方法重復處理，用于DNA提取。

1.4 豬膈肌中弓形蟲 DNA 的提取選取6種不同DNA提取試劑盒，分別提取制備的速的豬膈肌混懸樣品的基因組DNA，每種方法中每個濃度樣品重復3次。所有操作均嚴格按各自試劑盒的操作說明進行。提取的DNA置于-20℃保存，用于分子檢測。

1.5 引物合成參照文獻[5]，合成弓形蟲529 bp重復序列引物，由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。Toxo-529-F(上游引物):5'-CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3'，Toxo-529-R(下游引物): 5'-CTGCAGACACAGTG CATCTGGATT-3'。

1.6 PCR 擴增對弓形蟲529 bp重復序列進行擴增，反應體系：ddH2O 16 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、樣品DNA 2 μL。反應條件：94℃預變性7 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴增產物用1.0% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.7 不同方法提取的速殖子DNA用于PCR檢測的敏感性試驗用6種試劑盒分別提取含有不同數(shù)量弓形蟲速殖子的豬膈肌樣品的DNA，作為模板分別進行PCR擴增，擴增方法同1.6。用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物檢測，觀察每種方法的敏感性。所有提取方法均重復3次。

1.8 特異性試驗選取敏感性高、重復性好、價格相對低廉的DNA提取方法，提取含1×104個弓形蟲速殖子的豬膈肌樣品的DNA，以及牛帶絳蟲、旋毛蟲、日本血吸蟲成蟲、柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）、微小隱孢子蟲、泰澤隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲卵囊DNA，分別進行PCR擴增，檢測PCR方法的特異性。

1.9 市場采集樣品的檢測選取提取效率高、價格相對低廉的DNA提取方法，對實驗室2015年從上海市某屠宰場采集的126份田間豬膈肌樣品，進行DNA提取，作為模板，分別進行PCR檢測，并與本實驗室之前采用另一種方法對同一批樣品提取的DNA的檢測結果[10]進行比較。

2 結果與討論

2.1 不同方法提取的速殖子DNA用于PCR檢測的敏感性比較對添加了不同數(shù)量弓形蟲速殖子的豬膈肌樣品，采用6種DNA提取試劑盒分別進行基因組DNA提取。各種試劑盒提取的基因組DNA的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，可以用于下一步的PCR檢測。

以提取的DNA作為模板，分別進行PCR檢測，進行3次重復。結果顯示，以不同方法提取的速殖子DNA為模板進行PCR檢測，敏感性存在差異。EZNA Tissue DNA Kit和TIANamp Genomic DNA Kit提取的DNA進行PCR檢測的敏感性最高，2次對含有1×101個及以上速殖子、1次對1×102個及以上速殖子的豬膈肌樣品提取的DNA檢測為陽性；其次是FastDNA Spin Kit for Soil，1次對含1×101個速殖子及以上樣品、2次對含1×102個速殖子及以上的樣品檢測為陽性；GeneJET Genomic DNA Purification Kit 2次對1×102個速殖子及以上、1次對1×103個速殖子及以上樣品檢測為陽性；而海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒和TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，只能檢測出含1×103個速殖子及以上的樣品（圖1、表1）。

PCR結果比較顯示，EZNA Tissue DNA Kit、TIANamp Genomic DNA Kit 和FastDNA Spin Kit for Soil提取DNA進行PCR檢測的敏感性最高。在這三種試劑盒中，F(xiàn)astDNA Spin Kit for Soil操作繁瑣，價格昂貴；EZNA Tissue DNA Kit提取所耗時間和TIANamp Genomic DNA Kit 相差不大，但是價格相對TIANamp Genomic DNA Kit 更加昂貴。因此，三種試劑盒中TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒不僅敏感性高、特異性好，而且價格經濟實惠。沈海英等[11]比較了5種提取弓形蟲速殖子基因組 DNA的方法，分別為試劑盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯

仿法和鹽析法，發(fā)現(xiàn)酚-氯仿法效果最好，能夠擴增出的最低值為1×101個速殖子。但是該檢測只是單純的提取速殖子基因組，并未模擬豬膈肌中弓形蟲的感染情況，對于豬膈肌中存在的弓形蟲DNA的提取結果可能會存在差異，而且酚-氯仿法操作繁瑣、費時、對操作者存在一定毒性，不適合大批量市售豬膈肌樣品的檢測。本研究模擬了豬膈肌中弓形蟲感染情況，篩選到了3種簡便、快捷、高效的適合于豬膈肌中弓形蟲分子檢測的DNA提取方法，其中TIANamp Genomic DNA Kit提取法更加經濟實惠，適合于開展大規(guī)模的田間豬肉樣品中弓形蟲攜帶調查研究。

A： 海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒; B： EZNA Tissue DNA Kit; C： GeneJET Genomic DNA Puri fication Kit; D： Takara MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0; E： TIANamp Genomic DNA Kit; F： FastDNA Spin Kit for Soil; 1： 添加1×100 弓形蟲速殖子; 2： 添加1×101弓形蟲速殖子; 3：添加1×102弓形蟲速殖子; 4： 添加1×103弓形蟲速殖子; 5： 添加1×104弓形蟲速殖子; N： 陰性對照; M： DNA分子量標準(DL 2000)A： Marine Animal Tissue Genomic DNA Extraction Kit; B： EZNA Tissue DNA Kit; C： GeneJET Genomic DNA Puri fication Kit; D：Takara MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0; E： TIANamp Genomic DNA Kit; F： FastDNA Spin Kit for Soil; 1：1×100 tachyzoites were added; 2： 1×101 tachyzoites were added; 3： 1×102 tachyzoites were added; 4： 1×103 tachyzoites were added; 5：1×104 tachyzoites were added; N： Negative control; M： DNA Marker(DL 2000)

表1 6種試劑盒提取DNA的PCR檢測結果Table 1 PCR detection results of DNAs extracted by 6 kinds of kits

2.2 TIANamp法提取DNA用于PCR檢測的特異性試驗采用TIANamp Genomic DNA Kit方法對含 1×104個速殖子樣品提取DNA，與牛帶絳蟲、旋毛蟲、日本血吸蟲、柔嫩艾美耳球蟲、微小隱孢子蟲、泰澤隱孢子蟲和貝氏隱孢子蟲DNA分別進行擴增。結果顯示，只有弓形蟲速殖子樣品DNA在529 bp處出現(xiàn)1條目的條帶，其他寄生蟲DNA均未擴增出目的條帶（圖2）。

圖2 TIA Namp法提取弓形蟲DNA的PCR特異性檢測結果Fig. 2 Speci fic test of PCR for Toxoplasma gondii DNA extracted by TIA Namp法

拷貝數(shù)多的目的基因有助于提高PCR檢測的敏感性和特異性[12]。Homan等[13]發(fā)現(xiàn)了1個529 bp的弓形蟲特異性基因，命名為弓形蟲529 bp重復序列，該基因在弓形蟲基因組中多達 300 多個拷貝。以該基因為目標檢測基因，方強等[14]建立了常規(guī)PCR診斷方法，發(fā)現(xiàn)該方法具有很好的特異性。余莉等[5]選取不同基因對豬肉中弓形蟲攜帶情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)弓形蟲529 bp重復序列的敏感性最高。張瑩光等[15]建立了基于該序列的巢式PCR，可以檢測出0.1 pg的弓形蟲基因組DNA。孟鵬等[16]利用該基因設計半巢式PCR引物，檢測了土壤樣品中的弓形蟲。Bourdin等[17]利用該基因對人的血液和淚液樣本進行了檢測。徐前明等[18]利用該基因建立了弓形蟲環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法。本課題組詹婷婷等[10]也利用該方法對豬肉樣品中的弓形蟲進行了檢測。本研究選用該基因做為靶基因，對不同試劑盒提取的DNA模板進行檢測，發(fā)現(xiàn)以該基因為引物的PCR方法具有很好的特異性，這與文獻[14]研究結果相似，529 bp重復序列只能擴增弓形蟲DNA，對于健康志愿者全血、正常小鼠全血、間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲及結核桿菌基因組 DNA 均未能擴增出。

2.3 市售豬膈肌樣品的檢測對采集的126份豬膈肌樣品，用TIANamp Genomic DNA Kit提取基因組DNA，進行PCR擴增。結果顯示，共有5份弓形蟲陽性樣品（圖3），陽性率為3.97%。序列測定結果顯示，所有陽性擴增產物序列與GenBank登錄的剛地弓形蟲RH株529 bp重復區(qū)序列（登錄號：AF146527）同源性達100%。采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 提取的CPR結果為樣品中弓形蟲陰性率為3.17%（4/126）[10]。兩種方法提取的DNA檢測結果陽性符合率為100%，陰性符合率為99.18%，表明采用TIANamp Genomic DNA Kit 提取DNA，能夠提高豬肉樣品的檢出效率。當然，這一結論仍需更多樣品的檢驗結果來驗證。

圖3 部分市售豬膈肌樣品PCR檢測結果Fig.3 PCR detection of partial diaphragm samples