李詩(shī)言，王揚(yáng)，周凡，柯慶青，貝亦江，王鼎南，鄭重鶯，吳洪喜，丁雪燕

(浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，杭州 310023)

金剛烷胺類藥物是一種常見的抗病毒類藥物，具有三環(huán)胺結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于對(duì)抗流感病毒感染[1-2]，主要包括金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)。由于在畜牧業(yè)濫用金剛烷胺類藥物會(huì)帶來(lái)耐藥性及食物鏈傳遞導(dǎo)致的人體過(guò)量攝入等問題，中國(guó)農(nóng)業(yè)部早在2005年就已經(jīng)明確禁止其在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用[3]。烏鱧(OphiocephalusargusCantor)肉質(zhì)細(xì)嫩，是優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，長(zhǎng)期以來(lái)烏鱧的養(yǎng)殖攝食以冰鮮雜魚為主，但近兩年冰鮮魚價(jià)格上漲而雞肝、鴨肝卻有著較充足的供應(yīng)量，因此不少養(yǎng)殖戶紛紛轉(zhuǎn)用雞肝、鴨肝飼養(yǎng)烏鱧[4]。然而，少數(shù)不法分子仍然會(huì)在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中使用金剛烷胺類藥物進(jìn)行禽流感的預(yù)防和早期治療[5-7]。通過(guò)食物鏈的傳遞，雞肝、鴨肝中存在的金剛烷胺類藥物就可能在烏鱧體內(nèi)蓄積，從而產(chǎn)生新的水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，因此非常有必要建立烏鱧肌肉中高效、準(zhǔn)確、靈敏的金剛烷胺類檢測(cè)分析方法。

近年來(lái)，生物基質(zhì)中金剛烷胺類藥物的檢測(cè)方法已在文獻(xiàn)中廣泛報(bào)道，包括氣相色譜法[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-18]，其中LC-MS/MS方法因具有高特異性，高靈敏度且無(wú)需衍生化，應(yīng)用范圍最為廣泛。目前金剛烷胺類藥物檢測(cè)方法大都針對(duì)雞肉、雞蛋等禽類樣品，在水產(chǎn)品中的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。通常金剛烷胺類藥物主要通過(guò)C18色譜柱[10-15]或者親水作用(HILIC)色譜柱[16-18]進(jìn)行分析，但是金剛乙胺和美金剛互為同分異構(gòu)體，在LC-MS/MS分析中對(duì)色譜分離上有著更嚴(yán)苛的要求。本研究在樣品前處理上采用通過(guò)式固相萃取技術(shù)，所用試劑少、效率高，比較了不同類型色譜柱對(duì)金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的分離效果，并在此基礎(chǔ)上建立了優(yōu)化的LC-MS/MS分析條件，實(shí)現(xiàn)了烏鱧肌肉中3種金剛烷胺類藥物的快速準(zhǔn)確分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器主要包括ExionLC AD系列液相色譜儀(美國(guó) SCIEX公司)、4500 QTRAP 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó) SCIEX 公司)、Multi Reax全能型振蕩器(德國(guó) Heidolph 公司)、Allegra X-12高速離心機(jī)(美國(guó) BECKMAN 公司)和N-EVAP112水浴式氮吹濃縮儀(美國(guó)Organomation Associates，Inc)。

圖1 金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structures of amantadine,rimantadine and memantine

實(shí)驗(yàn)中用到的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括金剛烷胺(amantadine, AT)，金剛乙胺(rimantadine-D6, RT)，美金剛(memantine, MT)，金剛烷胺-D6(amantadine D6, AT-D6)和美金剛-D6(memantine-D6, MT-D6)，5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度均大于95%，由加拿大TRC公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)中用到的主要耗材及試劑包括Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL，美國(guó)Waters公司)，乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)，甲酸(色譜純，美國(guó)ROE Scientific INC.)和乙酸銨(色譜純，美國(guó)Fisher 公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛和2種同位素內(nèi)標(biāo)各10 mg，以甲醇為溶劑分別定容于25 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存。用上述儲(chǔ)備液準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)混合工作液以及質(zhì)量濃度為0.1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃儲(chǔ)存。

1.3 樣品制備

樣品采自浙江省內(nèi)烏鱧養(yǎng)殖場(chǎng)，分別取肌肉組織，清水洗凈后用干紗布小心吸除多余水分，放入攪拌機(jī)中制為勻漿狀，置于-20 ℃凍藏備用。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取烏鱧肌肉2.00 g，置于50 mL帶蓋的離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)混合工作液，移取5 mL 80%(V/V)的乙腈水溶液(含0.1%甲酸，V/V)于離心管中，充分渦旋混勻1 min后超聲提取5 min，8 000 r/min的速度高速離心5 min，轉(zhuǎn)移全部上清液于10 mL帶刻度比色管中，再向離心管中加入4 mL 樣品提取液，重復(fù)上述提取步驟，合并提取液，并用80%(V/V)的乙腈水溶液(含0.1%甲酸，V/V)定容至10 mL，待凈化。

1.4.2 樣品凈化

準(zhǔn)確移取2.5 mL 上述帶基質(zhì)樣品提取液，加于Oasis PRiME HLB柱(200 mg/6 mL)上，控制流速為1滴/s，自然流干后再加入1.0 mL 80%(V/V)乙腈水溶液(含0.1%甲酸，V/V)潤(rùn)洗柱子，收集全部流出液，于40 ℃下氮吹至近干。用0.5 mL 20%(V/V)乙腈水溶液復(fù)溶，溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 LC-MS/MS條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Kinetex F5(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸，V/V)；柱溫為40 ℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。梯度洗脫程序：0～1.0 min，97% B；1.0～1.1 min，97%～85% B；1.1～3.6 min，85%～65% B；3.6～5.6 min，65%～10% B；5.6～6.6min，10%B；6.6～6.7min，10%～97% B；6.7～9.0min，97% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源，正源模式，離子源溫度550 ℃，電噴霧電壓5 500 V，霧化氣(GS1)壓力345 kPa，輔助氣(GS2)壓力379 kPa，氣簾氣(CUR)壓力172 kPa，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將目標(biāo)藥物用甲醇稀釋配置成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的上機(jī)工作液，采用針泵進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。由于金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛均含有氨基，因此在ESI+模式下響應(yīng)較好，主要形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+。在確定目標(biāo)化合物母離子后進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行子離子掃描，其中金剛乙胺和美金剛互為同分異構(gòu)體(圖1)，二者子離子碎片具有高度的一致性，但相對(duì)豐度比卻存在著差異(圖2)。本研究選擇相對(duì)豐度最強(qiáng)的180.1>163.1同時(shí)作為金剛乙胺和美金剛的定量離子對(duì)，180.1>107.1作為美金剛的定性離子對(duì)，180.1>81.1作為金剛乙胺的定性離子對(duì)，這與Mu等[13]和Yumi等[15]的研究結(jié)果一致。優(yōu)化后3種金剛烷胺類藥物及2種同位素內(nèi)標(biāo)物的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)物化合物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometric parameters for target compounds

注：*表示定量離子。“—”示無(wú)。AT為金剛烷胺(amantadine)，RT為金剛乙胺(rimantadine)，MT為美金剛(memantine)，AT-D6為金剛烷胺-D6(amantadine-D6)，MT-D6為美金剛-D6(memantine-D6)，下同。

2.2 色譜條件的選擇

金剛乙胺和美金剛在質(zhì)譜條件下無(wú)法完全區(qū)分，因此選擇合適的色譜條件對(duì)兩者進(jìn)行分離是本研究的難點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)考察了4種型號(hào)的色譜柱對(duì)目標(biāo)藥物的分離情況，分別是Waters ACQUITY BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Thermo Fisher Syncronis HILIC(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和Phenomenex Kinetex F5(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)，并針對(duì)不同類型色譜柱的流動(dòng)相進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。結(jié)果可知BEH Amide和Syncronis HILIC色譜柱在HILIC分離模式下難以完全分離金剛乙胺和美金剛，方法適用性較差(圖3-1和圖3-2)，BEH C18色譜柱使用甲醇能夠基本實(shí)現(xiàn)金剛乙胺和美金剛的分離(圖3-3)，而乙腈由于洗脫能力更強(qiáng)不能對(duì)兩者實(shí)現(xiàn)分離，這與相關(guān)研究報(bào)道[10-11]的結(jié)果一致；Kinetex F5色譜柱使用甲醇后金剛乙胺和美金剛雖能分離，但峰形較差，而乙腈可使兩者色譜峰峰形更加對(duì)稱尖銳，同時(shí)實(shí)現(xiàn)基線分離。從圖3-3和圖3-4的對(duì)比可以看出，Kinetex F5色譜柱對(duì)金剛乙胺和美金剛的分離情況要好于BEH C18色譜柱，其填料含有五氟苯基，可與化合物發(fā)生偶極-偶極、電荷轉(zhuǎn)移和離子交換等相互作用，提高了對(duì)異構(gòu)體化合物的分離度[19]，是本方法中最為合適的分析柱。此時(shí)，液相方法流動(dòng)相有機(jī)相為乙腈，而水相為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸，V/V)，具體優(yōu)化后的色譜條件見1.5.1節(jié)。

圖2 金剛乙胺和美金剛的子離子質(zhì)譜圖(1)金剛乙胺；(2)美金剛。Fig.2 The daughter ion spectrums of rimantadine and memantine(1)Rimantadine；(2)Memantine.

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

金剛烷胺類藥物均含有氨基，屬于堿性化合物，在酸性溶液中易溶于極性試劑，通常其提取試劑主要為乙腈或甲醇與酸性溶液配制而成的混合提取液[10,11,13-18]。本研究中烏鱧樣品的主要基質(zhì)干擾成分為蛋白和脂類物質(zhì)，采用乙腈作為提取試劑具有良好蛋白沉淀效果，而PRiME HLB小柱能夠去除樣品基質(zhì)中的磷脂等非極性物質(zhì)。參考文獻(xiàn)[15]，本研究最終采用乙腈水溶液(含0.1%甲酸，V/V)作為樣品提取液，同時(shí)使用PRiME HLB通過(guò)式固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，省去了常規(guī)固相萃取方法的淋洗和洗脫步驟，具有高效和高通量的特點(diǎn)[20]。

圖3 不同色譜柱分離條件下目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μg·L-1)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜總離子流圖(1)BEH Amide色譜柱；(2)Syncroni HILIC色譜柱；(3)BEH C18色譜柱；(4)Kinetex F5色譜柱。 AT: 金剛烷胺；RT: 金剛乙胺；MT: 美金剛，下同。Fig.3 The total ion chromatograms (TICs)of target compounds in standard solutions (2 μg·L-1) by LC-MS/MS analysiswith different chromatographic column(1)BEH Amide；(2)Syncroni HILIC；(3)BEH C18；(4)Kinetex F5. AT: amantadine；RT: rimantadine；MT: memantine. The same below.

提取液中乙腈的比例會(huì)直接影響目標(biāo)化合物的提取效率和凈化效果，為此我們考察了不同提取試劑下經(jīng)PRiME HLB小柱處理后的凈化效果。分別向6份空白烏鱧樣品中加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，3種藥物的加標(biāo)水平均為5μg/kg，按照1.4.1節(jié)方法獲得加標(biāo)樣品提取液共計(jì)6份，按照1.4.2節(jié)方法取1 mL提取液通過(guò)SPE小柱獲得凈化后基質(zhì)溶液，以絕對(duì)回收率(absolute recovery，AR)考察了不同乙腈比例提取液的方法適用性。AR計(jì)算公式如下：AR(%)=(加標(biāo)樣品溶液信號(hào)強(qiáng)度/空白試劑加標(biāo)溶液信號(hào)強(qiáng)度)×100%；6份樣品的AR數(shù)據(jù)合并后按“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”進(jìn)行處理。如圖4所示，隨著乙腈比例的不斷提高，3種藥物的絕對(duì)回收率均為先快速升高再緩慢下降的趨勢(shì)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)乙腈比例低于70%時(shí)目標(biāo)化合物在SPE柱上無(wú)法完全被洗脫下來(lái)，影響了絕對(duì)回收率。當(dāng)乙腈比例高于70%時(shí)，隨著乙腈比例的進(jìn)一步提高，提取液極性變?nèi)跚蚁疵撃芰ψ儚?qiáng)，這會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物提取率的逐步下降并減弱了SPE小柱的凈化效果，造成基質(zhì)效應(yīng)的增加。由于金剛烷胺和金剛乙胺基質(zhì)效應(yīng)為增強(qiáng)效果，部分抵消了提取率的下降值，導(dǎo)致兩者絕對(duì)回收率下降幅度較低，而美金剛基質(zhì)效應(yīng)為抑制效果，因此絕對(duì)回收率下降幅度較大。最終，本研究選用乙腈比例為80%的樣品提取液，此時(shí)金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的絕對(duì)平均回收率相對(duì)較高，分別為93.7%、87.2%和75.1%，且穩(wěn)定性較好，具有良好的方法適用性。

圖4 提取液中不同比例乙腈對(duì)通過(guò)式固相萃取凈化后金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛絕對(duì)回收率的影響(n=6)Fig.4 The effects of different acetonitrile contents (%) in extracting solution for the absolute recovery of amantadine, rimantadine and memantine using an pass-through solid phase extraction purification methods(n=6)

SPE小柱的柱容量有限，上樣量過(guò)大會(huì)影響樣品的凈化效果，上樣量過(guò)小則會(huì)增大稀釋倍數(shù)造成方法靈敏度的降低，因此需要確定合適的上樣體積。本研究考察了上樣量對(duì)目標(biāo)化合物凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)提取液的上樣量超過(guò)3 mL后，凈化后樣品金剛乙胺和美金剛的基質(zhì)效應(yīng)開始顯著增加，考慮到稀釋倍數(shù)整除需要，最終確定上樣量為2.5mL(相當(dāng)于0.5 g 魚肉基質(zhì))。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析中普遍存在，是影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一，在質(zhì)譜檢測(cè)中共流出干擾物可對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)生一定程度的離子抑制或者增強(qiáng)作用[19-21]。本研究基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式如下：ME(%)=(基質(zhì)空白溶液加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度/空白溶液加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度)×100%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金剛烷胺和金剛乙胺存在基質(zhì)增強(qiáng)作用，美金剛存在基質(zhì)抑制作用，三者基質(zhì)效應(yīng)分別為113%、107%和84%(表2)。為確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，本研究采用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法的線性范圍、回歸方程與定量限

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合工作液和內(nèi)標(biāo)配制成6種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列梯度，依據(jù)優(yōu)化好的色譜、質(zhì)譜條件對(duì)6個(gè)濃度水平的系列梯度工作溶液進(jìn)行測(cè)定。3種目標(biāo)化合物均以其定量離子對(duì)峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)做內(nèi)標(biāo)定量工作曲線。結(jié)果見表2，3種目標(biāo)物的線性范圍均為0.5～100.0 μg/L，相關(guān)系數(shù)(r2)為0. 999 3～0. 999 7，表明各化合物具有良好的線性關(guān)系。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行定量限(LOQ)和檢出限(LOD)驗(yàn)證，以信噪比S/N大于3為方法的LOD，同時(shí)LOQ須滿足信噪比S/N大于10。本方法中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的LOD值分別為0.2、0.1和0.1 μg/kg；在0.5 μg/kg水平標(biāo)準(zhǔn)添加時(shí)，上述3種目標(biāo)化合物的信噪比S/N分別為17、35和42，滿足作為定量限的要求。本方法中，金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的LOQ均為0.5 μg/kg，優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4253—2015[16]的1 μg/kg。

表2 3種目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab.2 Regression equations and correlation coefficients (r2) of three analytes

2.5.2 回收率和精密度

按前述方法，取空白烏鱧肌肉樣品，做3個(gè)添加水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6次平行測(cè)定，結(jié)果見表3。方法中3種目標(biāo)物的平均回收率為91.7%～104.0%，RSD為4.6%～8.1%,說(shuō)明方法的精密度和準(zhǔn)確度可滿足分析檢測(cè)要求。如圖5所示，烏鱧空白加標(biāo)樣品各化合物色譜峰形良好，且目標(biāo)物出峰處無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

表3 空白烏鱧肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的加標(biāo)回收率和精密度 n=6

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)24批次烏鱧樣品進(jìn)行檢測(cè)，所有樣品均未檢出金剛烷胺類藥物殘留。質(zhì)控樣品金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的加標(biāo)量均為2.0 μg/kg，平均回收率分別為95.0%、94.5%和96.0%，RSD范圍為3.78%～6.71%，同時(shí)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4253—2015[16]對(duì)上述樣品進(jìn)行復(fù)測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明本研究方法可靠有效。

圖5 烏鱧加標(biāo)樣品中目標(biāo)物的MRM圖(5 μg·kg-1)Fig.5 MRM chromatograms of blank Ophiocephalus argus Cantor muscle added with the three drugs (5 μg·kg-1)

3 結(jié)論

本研究該方法采用基于通過(guò)型固相萃取技術(shù)的前處理方法，建立了烏鱧肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛的LC-MS/MS測(cè)定方法，采用Kinetex F5色譜柱實(shí)現(xiàn)了金剛乙胺和美金剛的有效分離，通過(guò)同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量完成了24批次養(yǎng)殖烏鱧樣品的檢測(cè)。相比基于經(jīng)典固相萃取的前處理方法，本方法前處理簡(jiǎn)便快捷，極大地提高了檢測(cè)效率，且適用于現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求，可用于烏鱧肌肉中3種金剛烷胺類藥物的快速篩查與準(zhǔn)確定量。