張濤，周劍光，吳金平，陳建武，何力

(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(武漢)，農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223)

達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)隸屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱘形目(Acipenseriformes)、鱘科(Acipenseridae)、鱘屬(Acipenser)，俗稱長江鱘、沙臘子，主要分布在長江中上游的干流和部分支流，為中國特有種[1]。20世紀(jì)中下葉以來由于過度捕撈、興修水利、船舶航運(yùn)、環(huán)境污染等因素造成達(dá)氏鱘野生種群數(shù)量銳減，按照世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)1994年評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)和1996年的評(píng)估結(jié)果，達(dá)氏鱘處于極危級(jí)(CR)[1-2]，1988年達(dá)氏鱘被列為國家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。為保護(hù)這一極具生態(tài)價(jià)值和科研價(jià)值的古老物種，中國政府通過頒布法律禁捕、建立自然保護(hù)區(qū)和增殖放流等措施來恢復(fù)達(dá)氏鱘種群[3]，取得一定成效。由于不同種魚類具有不同的形態(tài)特征，研究外部形態(tài)特征，通過形態(tài)測量獲取可數(shù)性狀和可量性狀數(shù)據(jù)，亦或構(gòu)建判別方程，可以直觀便捷地鑒定不同魚種類[4]。同工酶作為一種生化遺傳參數(shù)，在魚類的親緣關(guān)系與分類、物種鑒定中的基因表達(dá)與調(diào)控研究以及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面得到廣泛的應(yīng)用[5-6]。目前有關(guān)達(dá)氏鱘的報(bào)道主要集中在養(yǎng)殖管理[7-8]、生理學(xué)特性[9-11]、營養(yǎng)學(xué)特性[12-14]、分子生物學(xué)[15-17]以及發(fā)育生物學(xué)[18-19]等方面，但達(dá)氏鱘生化遺傳特性方面的報(bào)道罕見。本研究通過形態(tài)學(xué)描述觀察、測定可數(shù)可量性狀并結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，檢測不同組織中乳酸脫氫酶以及蘋果酸脫氫酶的表達(dá)情況。旨在從形態(tài)特征和生化遺傳角度豐富達(dá)氏鱘種質(zhì)資源方面的研究內(nèi)容，同時(shí)篩選出達(dá)氏鱘種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)，為支撐其種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、探討種質(zhì)鑒定在達(dá)氏鱘增殖放流過程中的應(yīng)用開展鋪墊性工作。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用達(dá)氏鱘于2017年3月采自農(nóng)業(yè)部中華鱘保育和增殖中心，為水泥池人工繁殖培育的幼鱘，總共30尾，體重126.0～453.0 g，均值(277.3±95.0) g；體長33.7～48.9 cm，均值(43.0±4.3) cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)測定

按照養(yǎng)殖魚類性狀測定的國標(biāo)方法GB/T 18654.3—2008的規(guī)定，用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)對(duì)30尾樣本魚進(jìn)行測定。可數(shù)性狀包括背鰭和臀鰭的鰭式、背骨板數(shù)、左側(cè)骨板數(shù)、右側(cè)骨板數(shù)、左腹骨板數(shù)、右腹骨板數(shù)以及左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)，共計(jì)7個(gè)參數(shù)?？闪啃誀畎w長、體高、頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高，共計(jì)8個(gè)參數(shù)。

1.2.2 組織酶液的制備

組織酶液的制備方法參照文獻(xiàn)[20]。首先在所測樣本中隨機(jī)選取4尾魚，進(jìn)行同工酶的普遍篩查，結(jié)合初步篩查結(jié)果確定某種組織的某種同工酶是單態(tài)，再對(duì)所測樣本中另10尾健康達(dá)氏鱘的該種組織該同工酶進(jìn)行驗(yàn)證，以初步確定達(dá)氏鱘種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。

于水中剪鰓放血后，迅速摘取心臟、眼睛晶狀體、肌肉和肝臟4種組織，此過程中實(shí)驗(yàn)魚處于冰浴環(huán)境，盡可能減少摘取組織過程中的不適與痛苦。各組織經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后，放入低溫冰箱(-80 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品稱重后放入洗凈預(yù)冷的勻漿器內(nèi)，按質(zhì)量體積比1∶3(g/mL)加預(yù)冷雙蒸水，冰浴條件下反復(fù)研磨至漿狀，隨后在4 ℃16 097 ×g下離心3次，每次30 min，上清液分裝，-80 ℃保存以備電泳。

1.2.3 電泳方法

同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為4%，電極緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸。電泳采用穩(wěn)壓方式，電壓220 V，電泳8 h結(jié)束。

1.2.4 染色方法

電泳結(jié)束后將凝膠板取下，室溫避光染色，乳酸脫氫酶染色方法參照余來寧等[21]的方法 ，蘋果酸脫氫酶的染色參照孟彥等[22]的經(jīng)典染色方法，略加修改。待出現(xiàn)清晰條帶后，將凝膠板用去離子水漂洗2～3次。將漂洗后的凝膠板平放在自制燈箱上，用尼康數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.5 模式圖的繪制

采用Bandscan 5.0電泳圖譜中的酶帶進(jìn)行灰度識(shí)別，并根據(jù)識(shí)別灰度繪制電泳圖譜模式圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得可量性狀數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0(IBM公司，美國)進(jìn)行分析，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述及可數(shù)、可量性狀

觀測30尾達(dá)氏鱘，其體延長呈梭狀(圖1)。頭較小，呈楔形?？谙挛唬瑱M裂狀。具觸須2對(duì)，位于吻部腹面。眼位于頭側(cè)上方。背鰭高，鰭基部長，起點(diǎn)在腹鰭起點(diǎn)后上方，鰭式D. (43～45)；胸鰭長，位于胸部腹側(cè)；腹鰭、臀鰭較短小，臀鰭鰭式A.(25～39)；尾鰭歪形，上葉長于下葉。魚體背部、體側(cè)及腹部共具骨板5行。體表骨板以外區(qū)域裸露，具顆粒狀小突起。背部和體側(cè)上半部青灰色，下半部白色，腹部黃白色。各鰭青灰色，邊緣為灰白色。

圖1 達(dá)氏鱘外觀形態(tài)Fig.1 Morphological measurement of Acipenser dabryanus

達(dá)氏鱘鰾1室，前部膨大，兩側(cè)略突起，向尾部逐漸變細(xì)。鰾管與食道相連。胃呈“J”型，具7～8個(gè)螺旋瓣。腹膜銀白色。達(dá)氏鱘可數(shù)、可量性狀分別見表1，表中范圍給出了所測各指標(biāo)的上下限，均值反映了所測數(shù)據(jù)的集中程度?？蓴?shù)性狀中左右側(cè)骨板以及左右腹骨板數(shù)均不同，背骨板數(shù)相對(duì)較少?？闪啃誀钪兄饕泽w長和頭長為參照，給出了吻長、眼徑和眼間距等頭部主要參數(shù)與頭長的比例關(guān)系，也反映了體高、尾柄長和尾柄高等軀干部主要參數(shù)與體長的比例關(guān)系。

表1 達(dá)氏鱘的可數(shù)性狀和可量性狀的均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 The mean values and standard deviation of countable and measurable parameters of Acipenser dabryanus n=30

2.2 乳酸脫氫酶的表達(dá)

達(dá)氏鱘的LDH同工酶表達(dá)結(jié)果如圖2所示，在達(dá)氏鱘4種組織中共檢測到9條LDH酶帶，將靠近陽極最近的一條帶定義為LDH1，自陽極向陰極方向依次編號(hào)為LDH2、LDH3……LDH9。不同組織中酶帶數(shù)目和活性不同，呈現(xiàn)出明顯的組織特異性。心臟組織中共檢測到9條酶帶，其中LDH1～LDH7活性較強(qiáng)，LDH9活性最弱，2號(hào)魚和4號(hào)魚酶譜相同，都檢測到9條帶，1號(hào)魚酶帶數(shù)最少，僅有7條。眼睛晶狀體組織中共檢測到7條酶帶，4尾不同樣本魚酶帶條數(shù)和活性程度不同，LDH1只在1號(hào)魚中有檢出。LDH4只在2號(hào)魚中有檢出。肌肉組織中共檢測到8條LDH酶帶，4尾樣本魚的酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度不同，2號(hào)魚和4號(hào)魚酶帶數(shù)最少，僅見4條，3號(hào)魚酶帶數(shù)最多，共檢測到7條，肌肉LDH1、LDH2和LDH3為一個(gè)獨(dú)立的基因編碼區(qū)。肝臟組織中共檢測到7條酶帶，4尾樣本魚LDH酶帶數(shù)相同，LDH1表達(dá)活性最強(qiáng)，為一個(gè)獨(dú)立的基因編碼區(qū)，LDH2次之，其余5條酶帶表達(dá)活性程度均較弱。

2.3 蘋果酸脫氫酶的表達(dá)

達(dá)氏鱘的MDH同工酶的表達(dá)如圖3所示，在達(dá)氏鱘4種組織中共檢測到5條MDH酶帶，將靠近陽極最近的一條帶定義為MDH1，自陽極向陰極方向依次編號(hào)為MDH2、MDH3……MDH5。不同組織中酶帶數(shù)目相同，但活性不同，也呈現(xiàn)出一定的組織特異性。心臟組織中共檢測到5條MDH酶帶，4尾樣本魚的酶帶數(shù)和表達(dá)活性相同，MDH1、MDH3和MDH5表達(dá)活性較強(qiáng)，其余2條酶帶表達(dá)活性相對(duì)較弱。相對(duì)其余3種組織所有樣本魚的眼睛晶狀體組織中MDH酶帶表達(dá)活性較強(qiáng)，4尾樣本魚都檢測到5條MDH酶帶，和在心臟組織中的表達(dá)情況相同，MDH1、MDH3和MDH5表達(dá)活性也較強(qiáng)，其余2條酶帶表達(dá)活性相對(duì)較弱。肌肉組織中都檢測到5條MDH酶帶，但不同樣本魚表達(dá)活性程度不同，3號(hào)魚表達(dá)活性程度最弱，2號(hào)魚相對(duì)表達(dá)較強(qiáng)。所有樣本魚肌肉組織中MDH1和MDH3表達(dá)活性均較強(qiáng)，MDH4和MDH5表達(dá)活性相對(duì)較弱。4尾樣本魚肝臟中均檢測到5條酶帶，和肌肉情況類似，MDH1和MDH3表達(dá)活性也都較強(qiáng)，MDH4和MDH5表達(dá)活性相對(duì)較弱。

2.4 達(dá)氏鱘特征生化遺傳參數(shù)

本研究中4尾樣本魚各組織LDH酶帶以及肌肉和肝臟中MDH酶帶均有多態(tài)，表現(xiàn)在不同樣本魚之間酶帶數(shù)不同，或者即使酶帶數(shù)相同但表達(dá)程度有差異。心臟中MDH酶帶數(shù)以及各樣本魚表達(dá)活性程度都相同，但心臟MDH有拖帶，而所有樣本魚眼睛晶狀體MDH不僅酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度相同，而且分離效果好，酶帶清晰，所以初步確定以眼睛晶狀體MDH作為從生化遺傳特征層面鑒定達(dá)氏鱘種質(zhì)的備選對(duì)象。隨機(jī)選擇10尾樣本魚的眼睛晶狀體進(jìn)一步電泳以驗(yàn)證眼睛MDH酶帶表達(dá)情況，10尾樣本魚眼睛MDH同工酶圖譜見圖4，全為單態(tài)。鑒于此，本研究確定以眼睛晶狀體MDH作為鑒定達(dá)氏鱘種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。

圖2 達(dá)氏鱘LDH電泳圖譜A、B、C、D分別表示心臟、眼睛晶狀體、肌肉和肝臟的LDH酶譜；1～4泳道分別表示不同個(gè)體的酶譜。Fig.2 Electrophoretogram of LDH isozymes in Acipenser dabryanusA, B, C, D show electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart, eye, muscle and liver，respectively.1—4 show the zymograms of different individuals.

圖3 達(dá)氏鱘MDH電泳圖譜A、B、C、D分別表示心臟、眼睛晶狀體、肌肉和肝臟MDH酶譜；1～4泳道分別表示不同個(gè)體的酶譜。Fig.3 Electrophoretogram of MDH isozymes in Acipenser dabryanusA, B, C, D show electrophoretograms of MDH isozymes expressed in heart, eye, muscle and liver respectively.1-4 show the zymograms of different individuals.

圖4 達(dá)氏鱘眼睛晶狀體組織MDH電泳圖譜1～10泳道分別表示不同個(gè)體的酶譜。Fig.4 Electrophoretogram of MDH isozymes expressed in eyes from Acipenser dabryanus1—10 show the zymograms of different individuals.

3 討論

3.1 達(dá)氏鱘的形態(tài)學(xué)比較

本研究結(jié)果與文獻(xiàn)中已報(bào)道達(dá)氏鱘的形態(tài)特征比較分析，發(fā)現(xiàn)有部分不同的地方。在可數(shù)性狀方面的不同見表2。造成可數(shù)性狀差異的原因除了與樣本量大小有關(guān)外，還可能與樣本魚的規(guī)格大小有關(guān)，如本研究中所測樣本魚均為1齡達(dá)氏鱘幼魚，體長范圍為33.7～48.9 cm；而四川省水產(chǎn)資源調(diào)查組[23]所測樣本魚既有幼魚，又有性成熟成魚，體長范圍為6.1～108.1 cm。達(dá)氏鱘幼魚和成魚在可數(shù)性狀上存在差異，如鰓耙數(shù)隨著體長的增長而增加[23]，在其他魚類也是類似的情況，如鰱的鰓耙數(shù)隨全長增長的變化曲線呈一弧形，而鳙幾乎呈一直線，兩者鰓耙數(shù)都是發(fā)育過程前期增長快[24]；尼羅羅非魚在體長5.6～35.0 mm時(shí)，鰓耙數(shù)隨身體增長而增加[25]。無論尼羅羅非魚還是達(dá)氏鱘，鰓耙數(shù)目遠(yuǎn)小于鰱鳙，可能與其濾食能力不及鰱鳙強(qiáng)有關(guān)。在可量性狀方面，除頭長/眼間距外，其他諸如體長/體高、體長/頭長等參數(shù)的變動(dòng)范圍，本研究所得結(jié)果與四川省水產(chǎn)資源調(diào)查組[23]吻合；但本研究與四川省水產(chǎn)資源調(diào)查組關(guān)于頭長/眼間距的研究結(jié)果分別為2.70～3.29和2.9～3.7，造成這一差異的原因除了與所測樣本魚的規(guī)格和樣本量大小有關(guān)，還可能與測量方法有關(guān)。如本研究的測量方法遵照養(yǎng)殖魚類性狀測定的國標(biāo)方法GB/T 18654.3—2008中的眼間距規(guī)定，即眼間距為左右兩眼眶上緣的直線距離，而20年前四川省水產(chǎn)資源調(diào)查組[23]關(guān)于眼間距的測量起始點(diǎn)尚不清楚，不排除是由參數(shù)測量起始點(diǎn)不同而導(dǎo)致的結(jié)果差異。

表2 達(dá)氏鱘可數(shù)性狀的比較Tab.2 Comparsions of countable parameters of Acipenser dabryanus

3.2 同工酶表達(dá)的組織特異性

本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鱘的各種組織中均能檢測到LDH和MDH同工酶的表達(dá)，說明達(dá)氏鱘體內(nèi)LDH和MDH同工酶分布比較廣泛。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，兩種同工酶在達(dá)氏鱘組織中的表達(dá)具有組織特異性，即一種同工酶在同一個(gè)體的不同組織器官中表達(dá)的酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度不同。如LDH在達(dá)氏鱘心臟中共檢測到7～9條酶帶，而在肌肉中共檢測到2～4條酶帶，圖中酶帶顏色深淺程度不同和染色時(shí)兩種組織的顯色快慢佐證了LDH酶帶在心臟中表達(dá)活性相對(duì)比在肌肉中表達(dá)活性更強(qiáng)。除了LDH同工酶，MDH同工酶的表達(dá)也表現(xiàn)出組織特異性，如本研究中眼睛晶狀體組織MDH酶帶表達(dá)程度相對(duì)比肌肉中強(qiáng)。同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其表達(dá)受到溫度、壓力、激素、氧容量和營養(yǎng)等內(nèi)外因素的時(shí)空調(diào)控，致使其基因在各組織間的表達(dá)時(shí)間和強(qiáng)度不相一致，造成了不同組織同工酶酶譜的特異性[26]。

在脊椎動(dòng)物中，LDH是由A、B、C 3個(gè)基因位點(diǎn)編碼的四聚體蛋白質(zhì)，A、B基因在脊椎動(dòng)物各組織器官中普遍表達(dá)，而C基因的表達(dá)具有高度組織特異性，這種特異性依物種(特別是類群)不同而有明顯差別[27]。本研究中達(dá)氏鱘肝臟組織的LDH1酶帶可能是c帶，但可能又屬一類特殊的c帶，因?yàn)樵诟闻K組織表達(dá)的c帶一般會(huì)向陰極遷移[21,28]，而本研究中肝臟組織中的LDH1酶帶向陽極遷移，關(guān)于該LDH1酶帶是否為一類特殊c帶有待進(jìn)一步研究。

3.3 同工酶表達(dá)的個(gè)體差異性

本研究中達(dá)氏鱘4種組織LDH同工酶均表現(xiàn)出明顯的個(gè)體差異性，即不同個(gè)體LDH同工酶酶帶數(shù)不同，表達(dá)程度也存在差異，如3號(hào)魚的眼睛晶狀體組織和肌肉LDH酶帶數(shù)分別為2條和7條，而4號(hào)魚分別為3條和4條。4尾樣本魚的肝臟LDH酶帶數(shù)雖然均為7條，但4號(hào)魚的LDH6和LDH7表達(dá)活性程度要比其他3條魚強(qiáng)，即所測樣本魚的4種組織的LDH均存在個(gè)體差異性。所測樣本魚的肌肉和肝臟MDH雖然酶帶數(shù)相同，但均存在不同個(gè)體之間部分酶帶表達(dá)活性程度不同的現(xiàn)象，即亦存在個(gè)體差異性。該現(xiàn)象亦在其他學(xué)者研究過程中有類似發(fā)現(xiàn)，如余敏等[29]研究發(fā)現(xiàn)，云南高背鯽心臟中在EST-5在10尾樣本魚中僅部分表達(dá)，存在明顯的個(gè)體差異。分析這一現(xiàn)象的原因，可能是同工酶在同一物種不同個(gè)體相同組織中的表達(dá)存在差異，且與不同生長發(fā)育階段、健康狀態(tài)、地理環(huán)境(生境)等因素有關(guān)[30-32]。本研究中同工酶表達(dá)的個(gè)體差異可能與不同個(gè)體的大小或健康狀況有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

3.4 形態(tài)特征和同工酶分析在達(dá)氏鱘資源保護(hù)和利用中的應(yīng)用

達(dá)氏鱘作為國家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，近些年的增殖放流對(duì)保護(hù)這一珍稀水生動(dòng)物起到了一定的積極作用[33]。由于鱘形目魚類種間甚至屬間能雜交產(chǎn)生可育后代[34]，為防止天然水域鱘魚資源基因污染，增殖放流前應(yīng)對(duì)所放品種進(jìn)行種質(zhì)鑒定和評(píng)估，這也是中國對(duì)珍稀水生動(dòng)物增殖放流管理的要求。通過形態(tài)特征快速鑒定鱘魚種類就顯得格外便捷，如鰓耙數(shù)可作為鑒定中華鱘和達(dá)氏鱘的參考指標(biāo)之一[23,34]，本研究中達(dá)氏鱘可數(shù)、可量性狀以及外形特征觀察均可為達(dá)氏鱘幼魚的增殖放流前種質(zhì)鑒定提供參考資料。

本研究比較系統(tǒng)地報(bào)道了達(dá)氏鱘幾種主要組織中LDH和MDH的表達(dá)情況，通過達(dá)氏鱘兩種同工酶酶譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)眼睛晶狀體中MDH表達(dá)豐富且活性穩(wěn)定，可作為鑒定達(dá)氏鱘種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)，有利于為從生化遺傳層面比較達(dá)氏鱘與鱘形目其他魚類的親緣關(guān)系研究開展鋪墊性工作，并且為從生化遺傳角度評(píng)估達(dá)氏鱘不同群體的遺傳多樣性提供參考，同時(shí)可用于支撐其種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，并為其選育種提供參考依據(jù)，這一技術(shù)已運(yùn)用在鱘魚以及其他魚類中[33-35]。

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法觀測了達(dá)氏鱘幼魚的形態(tài)特征，重點(diǎn)對(duì)其可數(shù)、可量性狀進(jìn)行了討論分析，研究結(jié)果可在盡力避免損傷甚至宰殺達(dá)氏鱘這一國家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物前提下，從形態(tài)學(xué)特征角度，對(duì)其增殖放流過程中的種質(zhì)鑒定提供參考指標(biāo)。同時(shí)通過聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳對(duì)達(dá)氏鱘4種組織2種同工酶進(jìn)行了分析，初步確定了眼睛晶狀體中MDH表達(dá)豐富且活性穩(wěn)定，可作為鑒定達(dá)氏鱘種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。對(duì)達(dá)氏鱘同工酶的分析，有利于從生化遺傳層面比較達(dá)氏鱘與其他鱘形目魚類的親緣關(guān)系以及評(píng)估不同群體的遺傳多樣性提供參考資料。