王旭峰，陳海剛，莫夢松，王強，黎智廣，趙東豪

(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點開放實驗室，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，廣州 510300)

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning toxins，PSP)是一種分布廣泛的海洋生物毒素[1]，屬于四氫嘌呤衍生物[2]，毒性強烈，中國近海區(qū)域的消費者因誤食被毒素污染的貝類產(chǎn)品引發(fā)嚴重的中毒或死亡事件時有發(fā)生。其毒素作用機理與河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)類似，通過抑制鈉離子通道的傳輸而影響神經(jīng)的傳導，使人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用[3-5]。研究證實，PSP來源于有毒赤潮中的產(chǎn)毒藻類，多種亞歷山大藻(Alexandrium)、鏈狀裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)和巴哈馬梨甲藻(Pyrodiniumbahamense)等均分泌產(chǎn)生毒素[6-7]。濾食性貝類攝食這些產(chǎn)毒藻類，使PSP在體內(nèi)蓄積，造成潛在的食用風險。鑒于PSP對于貝類食用安全的危害，美國和歐盟等發(fā)達國家和地區(qū)都建立了各自相對完善的PSP監(jiān)測計劃、風險預警體系和管控措施。中國相關(guān)部門制定了一系列的貝類毒素衛(wèi)生質(zhì)量標準和赤潮預警及有毒赤潮應對措施，但是尚未建立起有效的PSP預警體系和風險監(jiān)測規(guī)范[8]。近年來中國沿海區(qū)域貝類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增長，生態(tài)環(huán)境破壞惡化加劇，海區(qū)水體經(jīng)常嚴重富營養(yǎng)化，赤潮爆發(fā)次數(shù)越來越多，沿海區(qū)域貝類PSP污染情形越來越多[4-6,9-11]，引起了相關(guān)部門的高度重視。

南海海域是國內(nèi)重要的經(jīng)濟貝類養(yǎng)殖區(qū)，人們因食用含毒素貝類導致的食物中毒事件時有發(fā)生，已引起廣泛關(guān)注。江天久等[8]對深圳海域貝類中PSP含量調(diào)查表明，染毒貝類的檢出率較高，認為南海海域?qū)儆赑SP的高發(fā)區(qū)域。冷科明等[6]采用小鼠生物法測定珠江口海域(珠江口、大鵬灣和大亞灣)貝類中的PSP，檢出的毒素含量普遍偏低。大鵬澳屬于開放性海域，與外海水體交換暢通，適宜經(jīng)濟貝類養(yǎng)殖，其中翡翠貽貝(Pernaviridis)又是易蓄積PSP的雙殼貝類。為了調(diào)查該海域PSP的污染水平，研究浮游植物潛在產(chǎn)毒藻的種類、豐度變化情況與翡翠貽貝體內(nèi)PSP含量的相關(guān)性，于2017年8月至2018年4月在大鵬澳海域每月定期采集翡翠貽貝和浮游植物樣品，測定石房蛤類毒素(saxitoxin，STX)、膝溝藻類毒素(gonyautoxin，GTX)和N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfocarbamoyl toxins)等13種PSP的含量，鑒定浮游植物的種類和豐度。

目前，文獻報道的PSP檢測方法主要有小鼠生物法(MBA)[12]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[13-14]、液相色譜法-熒光法(HPLC-FLD)[15-17]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[18-23]等。小鼠生物法作為AOAC推薦的PSP半定量分析方法，是唯一被大多數(shù)國家普遍接受和廣泛使用的標準方法，具有毒性反應直接、可靠的優(yōu)點，但無法區(qū)分樣品中的PSP種類[12]。ELISA法往往缺乏對所有毒素組分特異性強的抗體[13-14, 18]。HPLC-FLD法需要衍生化反應，且難以排除假陽性結(jié)果的干擾[15-16, 19]。LC-MS/MS法近年來以定性定量準確的技術(shù)優(yōu)點被應用于PSP的檢測。本研究采用石墨化碳黑固相萃取小柱凈化提取液，減少樣品稀釋倍數(shù)，經(jīng)超高效液相色譜分離，11 min內(nèi)完成樣品測定，方法操作簡單快速、靈敏可靠。通過研究PSP的含量變化與潛在產(chǎn)毒藻的種類、數(shù)量之間的關(guān)系，為相關(guān)部門完善和強化PSP監(jiān)測和風險預警提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

在大鵬澳海域設(shè)置SZ1、SZ2和SZ3共3個采樣點(圖1)，從2017年8月至2018年4月，每月中旬同時采集水樣、浮游植物和翡翠貽貝等樣品。

表層水樣：樣品瓶預先用純水沖洗干凈，且不與金屬器件接觸，采樣前再用現(xiàn)場海水沖洗2次。將5 L水樣，用20 μm的玻璃纖維微孔濾膜(Φ47)抽濾，然后收集濾膜，自然風干后，測定濾膜上固形物中PSP的含量。

浮游植物：按照GB17378.7—2007[24]中規(guī)定的方法，用淺水Ⅲ型浮游生物網(wǎng)進行底層至水面的垂直取樣。采集(～5 m)浮游植物樣品，經(jīng)中性甲醛溶液固定后，帶回實驗室鑒定。

翡翠貽貝：挑選大小均一的翡翠貽貝，每個樣品不少于500 g，用海水沖洗干凈后，放入雙層聚乙烯袋中，帶回實驗室于-18 ℃以下冰凍保存。去殼后，將樣品再分為整貝、內(nèi)臟團和其他可食組織3種樣品類型，分別用絞肉機制成肉泥狀，備用。

為比較不同貝類對PSP的蓄積能力差異，在設(shè)定站位附近也采集了近江牡蠣(Crassostrearivularis)樣品。去殼后，處理方法同翡翠貽貝。

圖1 貝類采樣站位圖Fig.1 Sampling stations for shellfish

1.2 儀器與試劑

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(配備Masslynx V4.1控制軟件)，購于美國Waters公司；5810臺式高速冷凍離心機，購于德國Eppendorf公司；MS3旋渦混合器購于德國IKA公司；去離子水發(fā)生器，購于美國Millipore公司；N-EVAP氮吹儀，購于美國Organomation公司。

13種PSP的標準溶液均購于加拿大國家研究委員會(NRC)；甲酸、乙腈及乙酸銨為色譜純，購于美國Thermo Fisher公司；石墨化碳黑固相萃取柱(250 mg，3 cc)，購于天津博納艾杰爾科技有限公司；0.22 μm尼龍66注射式濾器，購于天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；20 μm玻璃纖維微孔濾膜，購于英國Whatman公司；試驗用水為Milli-Q超純水；其他未做說明的化學試劑均為分析純，購于廣州市化學試劑廠。

1.3 樣品前處理

稱取(5.00±0.05) g貝類樣品，風干的浮游植物樣品同濾膜稱重后全部剪碎(去除濾膜的重量)，置于50 mL聚丙烯離心管中，再加入5 mL 2%乙酸水溶液，100 ℃水浴條件下提取10 min，待樣品冷卻后，8 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至15 mL聚丙烯離心管，待凈化。

石墨碳黑固相萃取柱使用前先用3 mL 20%乙腈-0.1%乙酸水溶液和3 mL 0.1%氨水平衡。準確移取1 mL提取液，加入5 μL氨水混合均勻，上柱，然后用3 mL純水淋洗小柱，1 mL 20%乙腈-0.1%乙酸水溶液洗脫。收集洗脫液，用乙腈稀釋至2 mL，12 000 r/min高速冷凍離心15 min，吸取上清液過0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器測定條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流速0.35 mL/min；流動相為0.1%甲酸乙腈(A)和5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(B)。梯度洗脫程序：0～8.0 min，10%～90% B；8.0～8.5 min，90% B；8.5～9.0 min，90%～10% B；9.0～11 min，10% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離(ESI)，正、負離子掃描；離子源溫度150 ℃；毛細管電壓3.0 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流量850 L/hr；碰撞氣流速0.20 mL/min，錐孔反吹氣流量150 L/hr；監(jiān)測方式為多時段-多反應監(jiān)測(multiple-period MRM)。

表1 13種PSP的質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.1 MRM parameters of 13 PSP

注：帶*為定量離子(Quantitative ion)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣及浮游植物中未測出PSP

現(xiàn)場用多參數(shù)水質(zhì)監(jiān)測儀測定海水的溫度、鹽度、pH和溶解氧等水質(zhì)指標。冬季測得的最低水溫為11.5 ℃，夏季時最高達31.2 ℃。鹽度為30.5～34.1，大鵬澳海域與外海暢通，鹽度變化較小，降水較多的月份，鹽度會隨之降低，大多月份維持在33～34。pH值為7.71～8.03，溶解氧為3.24～11.43 mg/L。水質(zhì)樣品采用固相萃取法處理，未檢出PSP，可能是海水中的毒素含量遠遠低于方法檢測限所致。水樣用隔膜真空泵經(jīng)玻璃纖維微孔濾膜抽濾，收集濾膜上的浮游植物，測定PSP含量，所有月份的樣品均未檢出，結(jié)合浮游植物的鑒定結(jié)果，可能與產(chǎn)PSP的甲藻豐度太低有關(guān)。此外，海水抽濾后獲取的浮游植物樣品較少，也是浮游植物樣品中難以檢出PSP含量的另一原因。

2.2 翡翠貽貝樣品檢測結(jié)果

從2017年8月至2018年4月，每月中旬采樣1次，共采集翡翠貽貝樣品11次，2017年8—11月均未檢出毒素。12月由于檢出了PSP，在元旦前后加密了翡翠貽貝的采樣頻次。開殼前，首先測定翡翠貽貝的生物學指標。不同月份翡翠貽貝的生長情況不同，8～12月份采集的翡翠貽貝樣品個體較大，殼體最長達8.5 cm;1～2月采集的翡翠貽貝樣品較小，長度約3.3 cm，體重為4.5～21.0 g。

2017年12月至2018年3月采集的翡翠貽貝樣品，檢出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等，共8種PSP，每種毒素的含量為2.12 ～ 354.55 μg/kg，這可能與冬季時該海域的水溫比較適宜分泌PSP的有毒藻生長有關(guān)。按照國際慣例，STX毒素的毒性因子被設(shè)為1，其他各種毒素按照其相對于STX的毒性大小來確定毒性因子(表2)，樣品中每種貝類毒素的毒力按照毒性因子，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STX的毒力當量來表示。將每個樣品檢出的不同種類PSP含量轉(zhuǎn)換為STX毒力當量，則翡翠貽貝蓄積的PSP的毒力當量為0.93～220.90 μg/kg(PSP的毒力以STX的毒力當量計，全文同)(表3)。

表2 PSP毒性因子[25]Tab.2 Toxicity factors of PSP

表3 大鵬澳翡翠貽貝樣品中PSP的檢出含量Tab.3 Detected content of PSP in Perna viridis samples in monitor sites of Dapeng Bay n=3

注：“—”示未檢出。毒素含量數(shù)值以“平均數(shù)±標準差”表示。

為比較翡翠貽貝與其他貝類對PSP的富集能力，在采集翡翠貽貝樣品時，同時在設(shè)定站位附近也采集了近江牡蠣樣品。檢測結(jié)果顯示，翡翠貽貝與近江牡蠣蓄積的PSP種類相同，但前者蓄積的毒素含量明顯高于后者，說明翡翠貽貝比近江牡蠣更易蓄積PSP。通常情況下，貽貝等雙殼貝類對PSP不敏感，藻類毒素對其攝食行為影響較小，其體內(nèi)容易蓄積較高濃度水平的毒素；相反，牡蠣對PSP高度敏感，當藻類中毒素含量較高時，其會產(chǎn)生減少貝殼開合、選擇性濾食等生理反應，以減少毒素的暴露。因此，與貽貝相比，相同環(huán)境條件下，牡蠣中PSP的含量往往較低[26]。

為了解貝體中不同部位的毒素含量，將去殼后的每個翡翠貽貝樣品，再分為整貝、內(nèi)臟團和其他可食性組織3種樣品類型，分別測定PSP的含量。結(jié)果顯示，內(nèi)臟團中PSP含量明顯高于貝體其他可食性組織，與其他人的研究結(jié)果一致[27-28]，所有檢出PSP的樣品的PSP的含量從高到低為：內(nèi)臟團>整貝>其他可食性組織。貽貝為濾食性貝類，其體內(nèi)的PSP為外源性毒素，通過濾食含毒的藻類而蓄積獲得，因此其內(nèi)臟團中的毒素含量最高。

2.3 浮游植物鑒定結(jié)果

實驗期間共采集的7次浮游植物樣品，按照GB17378.7—2007[24]中規(guī)定的方法進行鑒定，優(yōu)勢藻均為中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、柔弱角毛藻(ChaetocerosdebilisCleve)和柔弱菱形藻(Nitzschiadelicatissima)等硅藻，占浮游植物樣品總量的90%以上，其他藻類種類少，豐度低。將每月采集的樣品，按前六種優(yōu)勢藻出現(xiàn)的頻次作圖，結(jié)果見圖2，中肋骨條藻等的出現(xiàn)頻次最高，大多數(shù)月份均為第一或第二優(yōu)勢藻。

圖2 大鵬澳優(yōu)勢藻出現(xiàn)頻次(2017年9月—2018年3月)Fig.2 Frequency of dominant algae from Sep, 2017 to Mar, 2018 collected in Dapeng Bay

甲藻檢出較多的有具尾鰭藻(Dinophysiscaudata)、夜光藻(Noctilucascintillans)、大角角藻(Ceratiummacroceros)和叉角藻(Ceratiumfurca)等。夜光藻是主要的海洋赤潮發(fā)生藻之一，常分布于富營養(yǎng)化的海區(qū)，具發(fā)光能力，可形成赤潮，對漁業(yè)危害很大，但其本身不含毒素，不產(chǎn)生PSP。2017年11月的浮游植物樣品，甲藻總量達10%(圖3)，但未檢測到能分泌產(chǎn)生PSP的亞歷山大藻、鏈狀裸甲藻和巴哈馬梨甲藻等。

2.4 浮游植物與貝類中PSP的相關(guān)性

2017年12月的翡翠貽貝樣品檢出了GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8種PSP，含量最高為220.90 μg/kg(表3)。2018年1—2月仍從翡翠貽貝中檢出多種PSP，但含量迅速降至較低水平(圖4)，此時的甲藻數(shù)量較少，與之前的月份相當。2018年3月從翡翠貽貝中僅檢出了GTX5，毒素含量為0.93～2.09 μg/kg，4月的樣品未檢出任何PSP組分。上述結(jié)果說明，大鵬澳翡翠貽貝體內(nèi)PSP含量較低，且水體中被證明的能夠分泌產(chǎn)生PSP的甲藻數(shù)量也太少，故目前的研究結(jié)果尚無法揭示產(chǎn)毒藻的數(shù)量與貝類體內(nèi)PSP含量之間的相關(guān)性。

此外，具尾鰭藻可產(chǎn)生腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisoning toxins，DSP)，每月的浮游植物樣品均有檢出，預示著該海域的貝類可能會蓄積DSP，應當引起人們的注意。

本研究結(jié)果表明，大鵬澳翡翠貽貝中檢出的PSP種類多，但大多為毒性較低的毒素種類，采集樣品中最高毒性當量為220.90 μg/kg，尚未達到歐盟的限量標準800 μg/kg。但結(jié)合本實驗室多年來對該海域貝類中PSP的監(jiān)測情況，認為冬季仍有必要加強監(jiān)測大鵬澳海域貝類中PSP的污染狀況。

圖3 大鵬澳海域不同月份甲藻占比Fig.3 Proportion of dinoflagellate in different months collected in Dapeng Bay

圖4 大鵬澳翡翠貽貝中PSP毒力的時間變化趨勢總毒力為該日月中檢出的PSP平均值。Fig.4 Change tendency of toxicity of PSP in different monitor months in Dapeng Bay Total toxicicity refers to the average value of detected PSP in mid-month.

3 結(jié)論

本研究調(diào)查了深圳大鵬澳翡翠貽貝中PSP的污染情況及浮游植物的種類、豐度。從2017年12月至2018年3月的翡翠貽貝樣品中共檢出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8種毒素，每種毒素的質(zhì)量濃度為2.12～354.55 μg/kg，各個樣品PSP的含量為0.93～220.90 μg/kg。12月份樣品中PSP檢出種類最多，含量也最高。在浮游植物樣品采集期間，該海域的優(yōu)勢藻均為中肋骨條藻、柔弱角毛藻和柔弱菱形藻等硅藻，其他藻類種類少，豐度低。甲藻檢出較多的為具尾鰭藻、夜光藻等不產(chǎn)PSP的藻類，而塔瑪亞歷山大藻等產(chǎn)PSP的甲藻數(shù)量太少，且翡翠貽貝體內(nèi)PSP含量總體較低，因此目前的研究結(jié)果尚無法揭示產(chǎn)毒藻的數(shù)量與貝類體內(nèi)PSP含量之間的相關(guān)性。樣品中檢出的PSP種類多，但大多為毒性較低的毒素種類。盡管翡翠貽貝中PSP的含量未達到歐盟的限量標準800 μg/kg，冬季仍需加強監(jiān)測貝類中PSP含量。