于情情，王丹，馬越，王宇濱，張敏，趙煜煒，趙曉燕，*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110161；2.北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，北京市果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工重點實驗室，農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點實驗室，北京100097；3.龍大食品集團有限公司，山東萊陽265231）

花色苷（anthocyanins，ACN）是一類羥基和甲基化的2-苯基苯并吡喃陽離子與一個或多個糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的化合物[1]。具有黃酮類特有的C6-C3-C6碳骨架結(jié)構(gòu)，賦予果蔬顏色[2-3]。花色苷作為優(yōu)良的天然色素，有良好的應用前景。不同作物花色苷的含量和種類不同，紫玉米及篤斯越桔中均含有很高的天然花色苷。研究表明紫玉米及篤斯越桔花色苷加工貯藏過程中易降解，嚴重限制了其應用。此外，花色苷具有很好的清除自由基、抗炎、抗腫瘤等活性[4]，胃腸吸收穩(wěn)定性是其功能發(fā)揮的前提。血清蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，它能與許多內(nèi)源及外源化合物結(jié)合，并能結(jié)合生物體內(nèi)存在的多種微量元素，起到存儲與轉(zhuǎn)運的作用[5]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的結(jié)構(gòu)與人血清白蛋白高度近似，其三維結(jié)構(gòu)，由3個結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域包含兩個亞結(jié)構(gòu)域，亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對的方式構(gòu)成疏水腔，可與小分子化合物相互作用，提高其穩(wěn)定性，因此常用作研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用的模型蛋白[6]。BSA可以與槲皮素[7]、橘皮苷[8]、藍莓花色苷[9]相互作用，從而抑制其降解。近來，朱莉等報道紫玉米苞葉花色苷也可與BSA相互作用[10]，然而不同來源花色苷與BSA結(jié)合作用是否相同，結(jié)合后能否提高花色苷穩(wěn)定性及提高程度如何未有報道。本文采用熒光光譜、Zeta電位、粒徑分析等方法比較紫玉米花色苷、篤斯越桔花色苷與BSA的結(jié)合效果，并分析不同來源花色苷與牛血清白蛋白相互作用后提高胃腸吸收穩(wěn)定性的效果，為花色苷的產(chǎn)業(yè)化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫玉米苞葉（涿紫一號）：由北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心農(nóng)產(chǎn)品加工實驗室提供。

篤斯越桔提取物：北京綠色金可生物技術(shù)股份有限公司，花色苷含量20%。

甲醇（色譜純）：Dima技術(shù)公司；甲酸、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、鹽酸（分析純）：北京化工廠；三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）：北京銀豐科技發(fā)展有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：上海羅氏制藥有限公司。

1.2 儀器與設備

固相微萃取儀（Visiprep DL SPE）：美國Supelco公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BüCHI-R-215）：瑞士布奇公司；CHRIST真空冷凍干燥機（ALPHR Z-4 LD PLUS）：北京博勵行儀器有限公司；紫外分光光度儀（UV-1800）：日本島津公司；酶標儀（SpectraMaxi3）：美國丹納公司；納米粒度儀（Nanotrac Wave）：美國麥奇克有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫玉米花色苷的提取條件

取原料10 g，置于攪拌機中粉碎1 min，成粉末狀。使用的提取溶劑為體積分數(shù)60%的乙醇水溶液，并用1 mol/L的鹽酸將提取溶劑的pH值調(diào)至3；料液比為1 ∶50（g/mL）；提取溫度 50 ℃；提取時間 1 h；提取次數(shù)1次。提取結(jié)束后，將提取物進行過濾，其中上清液再放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋蒸以得到花色苷的粗提取物，溫度設為60℃。

1.3.2 紫玉米花色苷大孔樹脂純化條件

Amberlite XAD-8大孔樹脂預處理后，填裝在1.6 cm/60 cm的填裝柱中，將上述粗提物上樣，流速為7 mL/min，0.5%三氟已酸的水沖洗后，采用0.5%三氟已酸的乙醇洗脫，收集液體，45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液。

1.3.3 紫玉米花色苷濃縮液與篤斯越桔花色苷C18固相微萃取純化方法

C18柱用甲醇溶劑預處理后，采用甲醇、水溶劑將干擾組分洗脫下來，濃縮液上樣后以一定的流速通過柱子。采用水、乙酸乙酯溶劑將干擾組分洗脫下來，同時保持分析物仍留在柱上，洗脫劑甲醇將分析物洗脫在收集管中，45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液，冷凍干燥成干粉備用。

1.3.4 牛血清白蛋白與花色苷結(jié)合后熒光光譜測定

取一定量BSA固體溶于0.1 mol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，并用緩沖液稀釋至5.0×10-7g/mL，備用，取一定量的花色苷用DMSO溶解，得到1.0×10-4g/mL花色苷備用，取BSA儲備液400 μL于2 mL離心管中，向其中加入依次加入 1.0×10-4g/mL花色苷 0、40、80、120、160、200 μL，并用磷酸鹽緩沖液定容至 2 mL 使其濃度為（0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6g/mL）于25℃放置1 h，取混合溶液200 μL，于非透明96孔板中，利用酶標儀分析加入花色苷前后熒光光譜的變化，測定參數(shù)為激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長范圍290 nm～450 nm。

1.3.5 牛血清白蛋白與花色苷結(jié)合后結(jié)合量測定

BSA與紫玉米和篤斯越桔花色苷的結(jié)合量采用鹽析法[11]，使結(jié)合的紫玉米和篤斯越桔花色苷從未結(jié)合的紫玉米和篤斯越桔花色苷中分離開。在15 mL離心管中，加入1 mL BSA儲備溶液，再加入不同量的花色苷儲備溶液，配制花色苷與BSA的摩爾濃度比分別為 0、4、8、12、16、20、24、28、32 的溶液，加 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）定容至10 mL，用渦流振蕩器混勻。BSA的濃度為1.5×10-5mol/L，花色苷的濃度分別為 0、6×10-5、9×10-5、15×10-5、18×10-5、24×10-5、30×10-5、36×10-5、42×10-5、48×10-5mol/L。取制備好的納米顆粒溶液10 mL，緩慢加入過量硫酸銨粉末，均勻攪拌，直至體系中有未溶解的硫酸銨，再攪拌10 min，仍有未溶解的硫酸銨，靜置20 min后，取出上清液，放入離心管中，4℃條件下離心30 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min。取上清，用UV-Vis分光光度計檢測上清液中的花青素的含量，即游離花青素的含量（[Lf]），花色苷總量為[L]，而結(jié)合的花青素的量（[Lb]）即：

1.3.6 牛血清白蛋白與花色苷結(jié)合后Zeta電位與粒徑測定

取一定量BSA固體溶于0.1 mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液，并用緩沖液稀釋至1.5×10-4mol/L，備用，取一定量的花色苷用DMSO溶解，得到1.5×10-3mol/L花色苷備用，配制花色苷與BSA的摩爾濃度比分別為0、2、4、6、8、10的溶液，取 BSA 儲備液 1 mL 于 10 mL 離心管中，向其中依次加入1.5×10-3mol/L花色苷0、200、400、600、800、1000μL，并用磷酸鹽緩沖液定容至10mL，用渦流振蕩器混勻。使BSA濃度為1.5×10-4mol/L，花色苷濃度分別為 0、3×10-5、6×10-5、9×10-5、12×10-5、15×10-5mol/L于25℃放置1 h，取混合溶液1 mL于Nanotrac Wave儀器中測量粒徑及電勢。

1.3.7 牛血清白蛋白與花色苷結(jié)合后胃腸消化吸收穩(wěn)定性測定

取一定量BSA固體溶于0.1 mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液，并用緩沖液稀釋至1.5×10-4mol/L，備用，取一定量的花色苷用DMSO溶解，得到濃度分別為10.5×10-5、6×10-5mol/L，備用。取花色苷儲備液 5 mL于45 mL離心管中，向其中加入5 mL BSA，對照加入相應量的磷酸鹽緩沖液，依次向離心管中添加2.5 mL抗壞血酸溶液（0.9%NaCl、1%抗壞血酸水溶液）、2.5 mL 胃液（0.3%NaCl、0.11%KCl、0.15%CaCl2·2H2O、0.05%KH2PO4、0.07%MgCl2·6H2O），用 1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至4.0后，加入2.5 mL胃蛋白酶（0.52%豬胃蛋白酶）。氮吹5 min后在37℃下振搖30min，轉(zhuǎn)速為100 r/min。調(diào)節(jié)pH值至2.0，氮吹5 min，再振搖30 min。然后調(diào)節(jié)pH值至6.9，加入1.5 mL腸胰蛋白酶（0.4%豬胰蛋白酶、2.5%膽酸鹽、0.5%連苯三酚、1%生育酚），氮吹5 min，在37℃下保溫2 h，在5 000 r/min條件下離心20 min得上清液，模擬胃腸消化系統(tǒng)揭示消化吸收過程中花色苷與牛血清白蛋白自組納米顆粒后花色苷變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件Duncan新復極差法（P＜0.05），Origin 7.5軟件作圖；試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫玉米和篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合作用研究

BSA分子中主要含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸3種氨基酸殘基發(fā)射內(nèi)源熒光，在本試驗中激發(fā)光為260 nm，可認為蛋白質(zhì)所呈現(xiàn)的熒光源來自分子中的酪氨酸殘基[12-13]。通過熒光光譜可檢測花色苷與牛血清白蛋白結(jié)合后的熒光光譜變化，分析結(jié)合情況。

圖1反應了BSA與不同濃度花色苷在25℃條件下相互作用后熒光光譜的變化。

圖1 花色苷對BSA熒光光譜的影響Fig.1 Effects of anthocyanin on fluorescence spectra of BSA

由圖1可知，隨著紫玉米苞葉花色苷濃度的增加，BSA的熒光強度逐漸下降，這與Tang L等[14]對矢車菊-3-O-葡萄糖苷和BSA之間的熒光猝滅光譜結(jié)果一致。BSA熒光光譜的最大發(fā)射峰通常在330 nm處，由圖1可見，隨著紫玉米與篤斯越桔花色苷濃度的增加，BSA最大發(fā)射波長均（λmax）從330 nm到340 nm，光譜有紅移現(xiàn)象，進一步證明紫玉米與篤斯越桔花色苷與BSA之間存在一定的相互作用，疏水性下降且微環(huán)境中極性增加[15]。

2.2 紫玉米和篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合量比較

圖2為紫玉米和篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合量分析。

圖2 花色苷與BSA的結(jié)合量分析Fig.2 Binding capacity of BSA with anthocyanins

隨著紫玉米花色苷與BSA的濃度比由0增加到16，與BSA結(jié)合的紫玉米花色苷的量也逐漸增加；當紫玉米色苷與BSA的濃度比達到16時，即體系中紫玉米花色苷的濃度達到18×10-5moL/L時，BSA對紫玉米花色苷的結(jié)合達到了飽和。1 moL/L BSA最多可結(jié)合4 mol/L紫玉米花色苷。與紫玉米花色苷相似，隨著篤斯越桔花色苷與BSA的濃度比由0增加到24，與BSA結(jié)合的篤斯越桔花色苷也逐漸增加；當篤斯越桔花色苷與BSA的濃度比達到24時，即體系中篤斯越桔花色苷的濃度達到36×10-5moL/L時，BSA對篤斯越桔花色苷的結(jié)合達到了飽和。1 moL/L BSA可結(jié)合7 moL/L篤斯越桔花色苷（圖2）。BSA與篤斯越桔花色苷的結(jié)合量高于與紫玉米花色苷的結(jié)合量。劉建壘等[7]研究表明，1 moL/L BSA可結(jié)合10篤斯越桔花色苷，本研究表明1 moL/L BSA與紫玉米花色苷和篤斯越桔花色苷可結(jié)合的量分別為4 mol和7 mol，可見不同來源，不同結(jié)構(gòu)的花色苷與BSA的結(jié)合量不同。

2.3 紫玉米和篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合后粒徑及Zeta電位比較

圖3為花色苷與BSA結(jié)合后粒徑分析情況。

圖3 花色苷與BSA結(jié)合后的粒徑分析Fig.3 Partical sizes of BSA with anthocyanins

如圖3，紫玉米及篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合后粒徑小于10 nm，可見兩種花色苷均能與BSA結(jié)合形成納米顆粒?；ㄉ张cBSA結(jié)合時在達到飽和結(jié)合量前隨著花色苷濃度比例的增加即隨著結(jié)合量的增加，粒徑越來越大。進一步以摩爾濃度比10的條件下進行兩種花色苷粒徑的比較。紫玉米花色苷與BSA結(jié)合后平均粒徑為6.99 nm，篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合后平均粒徑為7.23 nm，紫玉米花色苷與BSA形成的納米顆粒較篤斯越桔花色苷粒徑小。

通過Zeta電位，對顆粒之間相互排斥的強度，表征膠體分散系的穩(wěn)定性[16]。Zeta電位的絕對值越高，體系越穩(wěn)定，反之，Zeta電位越低，越傾向于凝結(jié)或凝聚。Zeta電位與體系穩(wěn)定性之間的大致關系如下：0～±5 mV 快速凝結(jié)或凝聚、±10 mV～±30 mV 開始變得不穩(wěn)定、±30 mV～±40 mV 穩(wěn)定性一般、±40 mV～±60 mV較好的穩(wěn)定性、超過±61 mV穩(wěn)定性極好。花色苷與BSA的電勢分析見圖4。

圖4 花色苷與BSA的電勢分析Fig.4 ζ-potential of BSA with anthocyanins

如圖4，BSA 平均電勢為-73 mV[17]，超過±60 mV，其穩(wěn)定性極好，且?guī)ж撾姟．敿尤牖ㄉ蘸箅妱萁^對值明顯下降，紫玉米花色苷與BSA結(jié)合后Zeta電位絕對值下降至-71.9 mV，篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合后下降至-64.6 mV，可見紫玉米及篤斯越桔花色的加入對BSA的穩(wěn)定性影響較大。隨著紫玉米和篤斯越桔花色苷濃度的增加，與BSA結(jié)合后的平均電勢分別下降至-35.2 mV及-32.5 mV。盡管加入花色苷后電位下降，然而兩種花色苷結(jié)合BSA后Zeta電位絕對值均大于30 mV，可見形成的納米顆粒仍具有一定的穩(wěn)定性。

2.4 紫玉米和篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合后胃腸消化吸收穩(wěn)定性比較

花色苷食入后，被胃及小腸等消化器官吸收才能參與代謝過程，胃腸消化吸收穩(wěn)定性是花色苷食用功能發(fā)揮的重要前提。圖5為添加BSA后花色苷含量的變化。

圖5 花色苷與BSA在消化前后的花色苷吸光度Fig.5 Staility of anthocyanins with or without BSA in simulated gastricintestinal model

由圖5可知，加入BSA紫玉米花色苷及篤斯越桔花色苷含量都下降。進一步比較消化前后，可觀察到紫玉米花色苷及篤斯越桔花色苷含量均急劇下降，而添加BSA的花色苷含量下降則相對緩慢。

表1為花色苷結(jié)合BSA后消化吸收降解率的變化情況。

表1 紫玉米花色苷與篤斯越桔花色苷與BSA結(jié)合后消化吸收的降解率Table 1 The degradation rate of BSA with purple corn anthocyanins and Vaccinium uliginosum linn anthocyanins

根據(jù)表1所示，剛加入BSA時，紫玉米花色苷發(fā)生降解，降解率為14.92%，篤斯越桔花色苷的降解率為25.86%，BSA與花色苷的結(jié)合后篤斯越桔花色苷的含量降低程度較紫玉米花色苷大。通過模擬胃腸道吸收，測量花色苷的生物利用率，未加BSA的紫玉米花色苷及篤斯越桔花色苷的降解率分別為90.86%和88.05%。加入BSA后紫玉米花色苷降解率為15.56%，篤斯越桔花色苷的降解率為22.41%，明顯提高了花色苷的生物利用率，且對紫玉米花色苷的穩(wěn)定性提高效率高于篤斯越桔花色苷。

3 結(jié)論

紫玉米花色苷和篤斯越桔花色苷均與BSA發(fā)生相互作用形成較穩(wěn)定的10 nm左右粒徑的納米顆粒；紫玉米花色苷和篤斯越桔花色苷可結(jié)合的量分別為4 mol和7 mol，紫玉米花色苷與BSA的結(jié)合量小于篤斯越桔花色苷，且結(jié)合后形成的納米顆粒較篤斯越桔花色苷?。籅SA提高了紫玉米花色苷及篤斯越桔花色苷的胃腸吸收穩(wěn)定性，紫玉米花色苷的穩(wěn)定性提高效率高于篤斯越桔花色苷。