韓中惠，王曉敏，吳士瑩，張燕

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點實驗室，天津300071）

雜環(huán)胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs）是富含蛋白質(zhì)的食物在熱加工過程中形成的具有多環(huán)芳香族結(jié)構(gòu)的致癌致突變物的一類化合物。到目前為止，已經(jīng)從熱加工的肉類中分離鑒定了30多種的雜環(huán)胺[1-3]。動物實驗證明這些雜環(huán)胺具有增加罹患結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和食道癌等疾病的風險[4]。國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）把 PhIP、A&C、MeA&C、MeIQx、8-MeIQx、Trp-P-1、Trp-P-1和Glu-P-1列為2B類可能致癌物，把IQ等列為2A類致癌物[5]。

糖可以作甜味劑、調(diào)味劑、增稠劑、著色劑等，在肉制品加工中它也得到了廣泛的使用。所以深入研究肉制品中的糖對于雜環(huán)胺形成的影響具有十分重要的意義。最近研究人員發(fā)現(xiàn)在腌肉汁的配方中添加不同種類的糖會抑制烤雞肉大多數(shù)雜環(huán)胺（MeIQ，DiMeIQx，IQ，IQx，Norharman 和 Harman）的形成[6]；蜂蜜中存在的糖類物質(zhì)可以有效抑制牛肉中雜環(huán)胺的形成[7]。雖然關(guān)于糖對雜環(huán)胺形成的影響已經(jīng)有很多報道[8-10]，但是他們對于造成這些結(jié)果的原因并沒有給出明確的解釋說明。

糖在肉制品熱加工過程中不僅可以發(fā)生焦糖化反應(yīng)，也可以與肉中的氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)。而α-二羰基化合物恰好是焦糖化和美拉德反應(yīng)中重要的中間體，且α-二羰基化合物具有高度的化學(xué)活性，易進一步發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)[11-14]。在肉制品中雜環(huán)胺的形成與美拉德等相關(guān)反應(yīng)密切相關(guān)，所以肉制品中糖對雜環(huán)胺形成產(chǎn)生的影響可能與α-二羰基化合物存在密切的關(guān)系。但是目前，僅有糖對雜環(huán)胺形成影響的報道，沒有關(guān)于其與α-二羰基化合物存在關(guān)系的報道。

本文采用常見的烤肉食品體系，分析加工過程中糖的種類對雜環(huán)胺形成的影響，并探討作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PhIP、IQ、MeIQ 和 MeIQx標準品（98%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；丙酮醛（40%水溶液）、乙二醛（40%水溶液）、丁二酮、3-脫氧葡萄醛酮和葡萄糖醛酮：美國Sigma-Aldrich公司；甲酸銨、乙酸銨（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二胺：上海阿拉丁生化科技有限公司。

試驗所需的豬肉（土豬1號黑豬肉）自天津市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)樂購超市。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6410型高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer，HPLC-MS/MS）、Agilent 7890B/977A型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）：美國 Agilent公司；LC-20A型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本Shimadzu公司；12通道固相萃取儀：美國Sigma-Aldrich公司；RCT BS 25型磁力攪拌器和MS 3型渦旋混合器：德國IKA公司；FE20K型PH計：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R型離心機：美國Beckman公司；MGS-2200型氮吹儀：日本東京理化公司；GR18烤箱：中國瀾鑫電烤箱公司；固相萃取柱HyperSep C18（200 mg/5 mL）：美國 Thermo Scientific 公司；固相萃取柱 Si-SCX-2（200 mg/5 mL）：美國 SILICYCLE公司；固相萃取柱HLB：美國waters公司。

1.3 樣品的制備

烤肉的加工流程如下：

新鮮的肉→絞肉機絞碎→稱取30 g→分別加入不同種類的糖或者α-二羰基化合物→混合均勻→將肉壓制成直徑10 cm的圓形餅→使用油烤箱在一定溫度時間下加工→樣品

葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜的加入量分別為0.75、1.5、2.25 g和3 g，考察糖的種類及添加量對雜環(huán)胺形成和α-二羰基化合物形成的影響。

烤箱烤制的溫度為180℃，烤制的時間為30 min。溫度的控制±2℃范圍內(nèi)，時間以秒表準確計時。每組試驗重復(fù)進行3次?？局茰囟葧r間的是根據(jù)實際的食品加工情況設(shè)定的。

1.4 雜環(huán)胺的檢測

1.4.1 樣品前處理

在先前已有方法上進行改進，試驗步驟參考文獻[15-16]。首先，將一定量的碎肉加入氧氧化鈉溶液和甲醇均質(zhì)，并與硅藻土混合，用二氯甲烷洗脫；其次，將洗脫采用丙磺酸陽離子（Si-SCX-2）交換柱和C18固相萃取柱串聯(lián)萃??；最后，將樣品洗脫液用氮氣吹干然后用1 mL色譜純甲醇復(fù)溶、稀釋，再離心、過0.22 μm有機微孔過濾膜，將制得樣品暫存4℃下備用。

1.4.2 雜環(huán)胺分析方法

1.4.2.1 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱為 ZorbaxEclipsePlusC18（2.1mm×150mm，3.5 μm）；柱溫為 25 ℃；流速為 0.2 mL/min；流動相：A為甲酸銨（10 mol/L，pH=3.5），B 為乙腈；洗脫梯度為：0～12 min，10%～60%（B）；12 min～14 min，60%～10%（B）；進樣的體積為 1 μL。

1.4.2.2 質(zhì)譜（MS）條件

該質(zhì)譜使用的離子源為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；其霧化和碰撞的氣為氮氣；霧化氣壓力為0.28 MPa；毛細管電壓為4 000 V；干燥器流量為10 L/min；干燥器溫度為350℃；檢測模式為多重反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）。雜環(huán)胺的質(zhì)譜躍遷模式分別為：PhIP，m/z 225.3→m/z 210；IQ，m/z 199.2→m/z 184.2；MeIQ，m/z 213.3→m/z 198.2；MeIQx，m/z 214.3→m/z 199.2。

1.5 α-二羰基化合物的檢測

1.5.1 樣品前處理

參考文獻方法并加以改進[17]。首先，取一定量的肉樣，加入適當?shù)乃?甲醇（1/1，體積比）。其次，移取一定量的上清液，向上清液中加入衍生試劑鄰苯二胺（40 mg/mL）溶液水浴。最后，將衍生后的樣品經(jīng)固相萃取柱（HLB柱）純化，洗脫液過有機濾膜（0.22 μm）備用。

1.5.2 α-二羰基化合物分析方法

1.5.2.1 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱為 Polar-RP 80 A （2 mm×150 mm，4 μm）柱；柱溫設(shè)定為25℃；進樣體積設(shè)為5 μL流動相的流速為0.3 mL/min；流動相選擇0.1%甲酸水溶液為A相，甲醇為B相；洗脫的程序如下表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elute program of mobile phase

1.5.2.2 質(zhì)譜（MS）條件

離子源為ESI；霧化氣和碰撞氣為氮氣；霧化氣壓力為0.28 Mpa；干燥器溫度為350℃；干燥器流量為10 L/min；毛細管電壓為4 000 V；檢測模式為MRM。α-二羰基化合物被鄰苯二胺衍生后的質(zhì)譜躍遷模式分別為：MGO，m/z 145.1→m/z 77；GO，m/z 131.1→m/z 77；2，3-BD，m/z 159.2→m/z 131；3-DG，m/z 235.2→m/z 199.1；GS，m/z 251.2→m/z 173。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗所得到的數(shù)據(jù)以平均值標準偏差（mean±SD）表示。其相關(guān)數(shù)據(jù)通過方差分析（analysis of variance，ANOVA）和鄧肯測試（Duncan test）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件為IBM SPSS 19.0。作圖軟件為OriginPro 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法驗證

為了保證試驗測定結(jié)果的準確性，對雜環(huán)胺和α-二羰基化合物的檢測方法進行了詳細的方法學(xué)考察。其中考察的指標包括線性回歸方程、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantilty，LOQ）回收率以及相對標準偏差。雜環(huán)胺標品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)r2值如下表2。

表2 雜環(huán)胺的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 2 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for HAAs

樣品中雜環(huán)胺的檢出限LOD和定量限LOQ也在表2顯示。IQ，MeIQ，MeIQx和PhIP在樣品的回收率分別為78.4%～82.0%，76.8%～82.3%，85.4%～89.3%和75.1%～81.3%。IQ，MeIQ，MeIQx和PhIP的相對標準偏差分別為3.2%～4.5%，3.1%～4.2%，1.4%～3.7%和3.7%～5.2%。結(jié)果表明雜環(huán)胺各濃度水平的加標回收率和相對標準偏差均能達到檢測要求，說明本方法具有較高的準確性和可靠性，適用于本試驗檢測。

α-二羰基化合物標品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)r2值如下表3。

表3 α-二羰基化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 3 Regression equations，correlation coefficients and detection limits for α-DCs

樣品中α-二羰基化合物的檢出限LOD和定量限LOQ也在表3顯示。MGO，GO，2，3-BD，3-DG和GS在樣品的回收率分別為84.8%～90.2%，86.8%～94.8%，87.5%～89.4%，94.8%～97.1%和87.4～89.8%。此外，MGO，GO，2，3-BD，3-DG 和 GS的在樣品中相對標準偏差分別為 2.1%～4.7%，2.3%～4.0%，2.4%～5.5%，3.2%～4.2%和1.4%～3.5%。結(jié)果表明α-二羰基化合物各濃度水平的加標回收率和相對標準偏差均能達到檢測要求，說明本方法具有較高的準確性和可靠性。從以上的試驗數(shù)據(jù)表明，測定雜環(huán)胺和α-二羰基化合物的方法具有較高的準確性和可靠性，符合本研究的要求。

2.2 不同種類的糖對烤肉中雜環(huán)胺形成的影響

不同種類的糖對烤肉中雜環(huán)胺形成的影響見圖1。

圖1 不同種類的糖對烤肉中雜環(huán)胺形成的影響Fig.1 Effect of sugars on the formation of HAAs in oven roasted pork

從圖1a可以看出，隨著葡萄糖添加量的逐漸增加，生成雜環(huán)胺的總量以及PhIP、IQ、MeIQx和MeIQ的量均逐漸降低（p＜0.05），當糖的添加量在1.5 g時，各個雜環(huán)胺的生成量顯著降低（p＜0.05）；在最大添加量時，雜環(huán)胺的降低率均都達到85%以上。

4種添加糖類相比，果糖對各雜環(huán)胺的影響與葡萄糖的結(jié)果相似，4種雜環(huán)胺的含量均隨著果糖添加量的增加而降低（圖1b）；添加蔗糖時，4種雜環(huán)胺在一定程度上降低，但降低程度明顯低于葡萄糖和果糖（圖1c）；蜂蜜也會對這幾種雜環(huán)胺的形成產(chǎn)生影響，作用效果強于蔗糖，低于葡萄糖和果糖（p＜0.05）（圖1d）。從雜環(huán)胺被抑制程度看，這四種雜環(huán)胺中，PhIP被抑制的程度最高，IQ的最低。這種現(xiàn)象的形成可能與不同雜環(huán)胺之間的前體物密切相關(guān)。

2.3 不同種類的糖對α-二羰基形成的影響

肉餅中糖與形成α-二羰基化合物的關(guān)系如圖2。

圖2中表明在烤肉中添加糖（葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜）后有較多數(shù)量和種類的α-二羰基化合物形成。隨著葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜添加量的增多，丙酮醛的量也逐漸的增加；在添加蔗糖量為3 g時，丙酮醛形成的量最大（圖2a）。對于乙二醛，隨著各種糖的添加其形成的量較少，在一定程度上其與各種糖的添加量具有一定相關(guān)性（圖2b）。對于丁二酮，添加蔗糖時形成丁二酮的水平低于檢測限，葡萄糖和蜂蜜的添加量小于3 g時，烤肉中也沒有丁二酮形成（圖2c）。當葡萄糖添加量為0.75 g時，3-脫氧葡萄醛酮的形成量已經(jīng)達到（462.38±14.81）μg/g，顯著高于其它 α-二羰基化合物；但是蔗糖的添加小于或等于1.5 g時，其沒有3-脫氧葡萄醛酮的形成（圖2d）。葡萄糖醛酮的形成隨著葡萄糖、果糖和蜂蜜的添加量均顯著增多，而在加蔗糖的肉餅中葡萄糖醛酮沒有顯著變化（p＜0.05）（圖2e）。不同糖影響形成α-二羰基化合物產(chǎn)生的趨勢不一樣的主要原因可能是不同種類的糖及其產(chǎn)生的α-二羰基化合物之間的反應(yīng)活性不同造成的。

圖2 不同種類的糖對α-二羰基形成的影響Fig.2 Relationship between sugars and α-dicarbonyl compounds in oven roasted pork

2.4 烤肉中雜環(huán)胺形成與α-二羰基化合物形成的關(guān)系

以上結(jié)果表明在烤中葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜的逐漸加入會導(dǎo)致PhIP、IQ、MeIQ和MeIQx的形成量降低，而丙酮醛、乙二醛、3-脫氧葡萄糖醛酮和葡萄糖醛酮的形成量均逐漸增加。那么雜環(huán)胺的減少可能與α-二羰基化合物的形成存在一定的關(guān)系。對添加各種糖時形成雜環(huán)胺的總量與相應(yīng)的α-二羰基化合物形成總量進行相關(guān)性分析（圖3）。

數(shù)據(jù)顯示兩者之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson's r）分別為-0.952 0，-0.938 6，-0.972 7 和-0.974 9。相關(guān)性結(jié)果分析表明在添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜時，樣品中α-二羰基化合物的含量與雜環(huán)胺的含量均存在負相關(guān)性。

圖3 α-二羰基化合物與雜環(huán)胺之間的相關(guān)性Fig.3 Correlations between α-DCs and HAAs

3 結(jié)論與討論

烤肉中，添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜均可顯著抑制雜環(huán)胺（PhIP、IQ、MeIQ 和 MeIQx）的生成，且不同種類的糖對雜環(huán)胺的形成均存在顯著的量效關(guān)系。其中葡萄糖、果糖和蜂蜜對于各種雜環(huán)胺的抑制效果明顯高于蔗糖。同時，在烤制過程中添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜，α-二羰基化合物（丙酮醛、乙二醛、3-脫氧葡萄糖醛酮和葡萄糖醛酮）的產(chǎn)生量顯著增加，且均與糖量呈顯著量效關(guān)系。添加葡萄糖、果糖、蔗糖和蜂蜜時，α-二羰基化合物的形成總量與雜環(huán)胺形成總量之間呈負相關(guān)性。推測烤肉中糖對雜環(huán)胺形成的影響與α-二羰基化合物的產(chǎn)生有關(guān)，該結(jié)論與我們報道的模擬體系的研究結(jié)論一致，即α-二羰基化合物在糖抑制雜環(huán)胺形成中起著重要的作用，本文通過對實際樣品中雜環(huán)胺形成和α-二羰基化合物形成的相關(guān)性分析，進一步證明糖可能通過熱降解形成的α-二羰基化合物實現(xiàn)對食品中雜環(huán)胺的抑制作用[18]。