趙廷彬，陳暢，殷海松，孫愛友，喬長晟，4，*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院生物工程學院，天津300350；3.華東理工大學生物反應工程國家重點實驗室，上海200237；4.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術工程中心，天津300457）

聚蘋果酸（polymalic acid，PMLA）是一種水溶性脂肪族聚酯[1-2]，是蘋果酸的聚合物。蘋果酸是一種C4二羧酸，分子中含有羥基和羧基，通過分子結(jié)構(gòu)中羧基和羥基間的酯化作用聚合形成PMLA，因此PMLA分子結(jié)構(gòu)中含有大量的酯鍵、羥基和游離羧基[3-4]。PMLA具有高度的水溶性、吸水性、生物相容性、可降解性、可化學衍生性及無免疫原性等，這些獨特的性質(zhì)決定了PMLA在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理、可降解材料、食品包裝等方面有著廣闊的應用前景[5-7]。

出芽短梗霉合成的PMLA是一種胞外產(chǎn)物，在釋放過程中如果阻力增大，PMLA會在胞內(nèi)大量的積累，造成阻遏效應，PMLA的產(chǎn)量會下降，菌體的效能降低。表面活性劑作為一種同時含有親油基和親水基的有機化合物，已經(jīng)被廣泛地應用到眾多的現(xiàn)代工業(yè)領域中[8-9]。有研究表明，表面活性劑能夠增大細胞膜的通透性，有利于胞內(nèi)產(chǎn)物的外排和菌體對周圍營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[10-11]。

本文選取4種表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、曲拉通 X-100（Triton X-100）、吐溫 60（Tween 60）、吐溫 80（Tween 80），研究它們對出芽短梗霉生長和PMLA合成的影響，并對最佳影響因子的作用機理做了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌種

出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）：保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.3337。

1.1.2 材料

1）斜面培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基。

2）種子培養(yǎng)基：蔗糖60 g/L，酵母膏3 g/L，丁二酸2 g/L，硫酸銨 1 g/L，K2CO30.4 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.005g/L，玉米漿0.1%（體積分數(shù)），碳酸鈣20 g/L（單獨滅菌）。

3）基礎發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 100 g/L，蛋白胨35 g/L，KH2PO40.1 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 0.5g/L，MnSO40.05g/L，碳酸鈣20g/L（單獨滅菌）。

1.1.3 儀器和設備

UVmini-1240紫外/可見分光光度計：日本島津公司；SKY-2102搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺：蘇州凈化設備廠；SPK-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LD5-10高速離心機：北京醫(yī)用離心廠；Agilent 1100高效液相色譜分析儀：美國安捷倫科技有限公司；FACSCalibur型流式細胞儀：碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)

將保存于4℃的斜面上的菌取出用接種針轉(zhuǎn)接到新鮮的斜面上，并置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～4 d。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)

取出培養(yǎng)好的斜面，在無菌操作條件下，用無菌生理鹽水將斜面的孢子洗下，制成孢子懸液。然后按照10%（體積分數(shù)）的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL種子培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用8層紗布封好瓶口，置于溫度25℃恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)40 h。

1.2.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液在無菌條件下混勻，然后按照10%（體積分數(shù)）的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用8層紗布封好瓶口，置于溫度25℃恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)6 d。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體量測定

取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min。倒掉上清，在菌體沉淀中滴加3 mol/L的稀鹽酸溶液，中和發(fā)酵液中剩余的碳酸鈣，直到不再有氣泡產(chǎn)生為止，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清。用10 mL生理鹽水重懸菌體，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清，將離心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱量菌體干重（g/L）。

1.2.2.2 發(fā)酵液中PMLA的測定[12]

取10 mL發(fā)酵液于15 000 r/min離心10 min除去菌體，用移液管取5 mL上清液于水解反應釜中，同時加入等體積的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃條件下水解12 h，將PMLA完全水解為單體蘋果酸。高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography，HPLC）檢測水解前后的蘋果酸的含量，兩者之差即為PMLA的產(chǎn)量。

HPLC的檢測條件如下，色譜柱：Prevail C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）；柱溫：25℃；流動相（體積比）∶25 mmol/L KH2PO4溶液∶乙腈=95∶5（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至 2.5）；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL；紫外檢測波長：210 nm。

1.2.2.3 細胞膜脂肪酸組成的檢測

取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心2 min，棄上清液。向離心管中加入4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸菌體，8 000 r/min 離心 2 min，棄上清液，重復上述操作2次，收集菌體。按照參考文獻[13]中的方法進行菌體脂肪酸的提取與檢測。

1.2.2.4 熒光強度測定[14]

取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心2 min，棄上清液，并用PBS緩沖液洗菌2次。用PBS溶液稀釋菌體，使得菌體量控制在106個/mL～107個/mL。取0.5 mL菌體稀釋液，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，避光反應30 min后，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.2.5 電鏡檢測

參考文獻[15]中的試驗方法進行出芽短梗霉細胞膜結(jié)構(gòu)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS對出芽短梗霉生長和PMLA合成的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、0.05、0.1、0.5、1.0 g/L的陰離子型表面活性劑SDS，搖床發(fā)酵6 d，測定其菌體生長和產(chǎn)PMLA的情況，結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，隨著SDS濃度的增加，出芽短梗霉發(fā)酵后的細胞生物量和PMLA的產(chǎn)量都呈下降趨勢，并且菌體生物量和PMLA的產(chǎn)量都比空白組低，說明SDS對發(fā)酵過程抑制作用比較明顯。隨著SDS添加量的增大，菌體生物量和PMLA產(chǎn)量的下降的幅度逐漸變小。當SDS添加量達到0.5 g/L后，菌體生物量和PMLA產(chǎn)量就不再發(fā)生較大的變化。由此得出，較低濃度的SDS對出芽短梗霉的生長和PMLA的合成表現(xiàn)出了較強的抑制能力。

圖1 添加SDS對出芽短梗霉生長和PMLA合成的影響Fig.1 Effect of SDS addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

2.2 曲拉通X-100對出芽短梗霉生長和PMLA合成的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0、5、10、20、40 g/L的曲拉通X-100，搖床培養(yǎng)6 d后，測定其菌體生物量和PMLA產(chǎn)量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 添加Triton X-100對出芽短梗霉生長和PMLA合成的影響Fig.2 Effect of Triton X-100 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

從圖2中可以看出，加入曲拉通X-100后，生物量和PMLA產(chǎn)量的變化趨勢是不一致的。當曲拉通X-100濃度小于10 g/L時，PMLA產(chǎn)量隨曲拉通X-100添加量的增加先降低后升高，并當曲拉通X-100濃度為5 g/L時，PMLA的產(chǎn)量最低，是17.21 g/L，其產(chǎn)量較對照組下降了36.89%。當曲拉通X-100濃度高于10 g/L后，隨曲拉通X-100濃度增大PMLA產(chǎn)量逐漸下降。整體來看，曲拉通X-100對PMLA的產(chǎn)量沒有提高作用。但加入曲拉通X-100可以促進出芽短梗霉細胞的生長，隨著曲拉通X-100濃度的增大，生物量先上升，隨后有所下降，并在曲拉通X-100濃度為5 g/L時，生物量達到最大。結(jié)合曲拉通X-100對生物量和PMLA產(chǎn)量的影響，可以得出，在低濃度曲拉通X-100范圍內(nèi)（小于5 g/L），培養(yǎng)基中的碳源主要用于菌體生長，由于對碳源的競爭性利用，導致PMLA產(chǎn)量下降。在高濃度范圍內(nèi)（大于5 g/L），雖然菌體量和空白組相接近，但在菌體內(nèi)部PMLA合成酶系可能受到高濃度曲拉通X-100的抑制，導致PMLA的產(chǎn)量低于對照組。

2.3 吐溫60對出芽短梗霉生物量和PMLA產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0、1、2、5、10、15 g/L的吐溫60，搖床培養(yǎng)6 d后，測定其菌體生物量和PMLA產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 添加Tween 60對出芽短梗霉生長和PMLA合成的影響Fig.3 Effect of Tween 60 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

從圖3中可以看出，加入吐溫60對出芽短梗霉菌體生長和PMLA合成的影響是有區(qū)別的。在較低濃度范圍內(nèi)（吐溫60濃度小于2 g/L），PMLA的產(chǎn)量隨吐溫60添加量的增加而提高，并在吐溫60濃度為2 g/L時PMLA產(chǎn)量最高，達到28.87 g/L，較對照組產(chǎn)量提高了20.86%。而添加吐溫60對于出芽短梗霉菌體生長有促進作用，并在適當?shù)臐舛确秶鷥?nèi)（吐溫60濃度小于5 g/L），菌體量隨著吐溫60添加量的增多而增大。

2.4 吐溫80對出芽短梗霉生長和PMLA產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0、1、2、5、10、15 g/L的吐溫80，搖床培養(yǎng)6 d后，測定其菌體生物量和PMLA產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 添加Tween 80對出芽短梗霉生長和PMLA合成的影響Fig.4 Effect of Tween 80 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

由圖4可知，隨著吐溫80濃度增加，PMLA的產(chǎn)量較空白對照組有所提高，并在吐溫80添加量為2 g/L時PMLA產(chǎn)量最高，達到31.36 g/L，較空白對照組提高了30.5%。但當吐溫80濃度大于10 g/L時，PMLA的產(chǎn)量急劇下降，并且低于空白對照組。菌體生物量隨著吐溫80的添加，濃度有所提高，說明吐溫80能促進出芽短梗霉菌體的生長。

由以上試驗可得，吐溫60和吐溫80對出芽短梗霉產(chǎn)PMLA都有促進作用，且吐溫80比吐溫60的作用效果好，因此選用吐溫80作為最佳影響因子進行后續(xù)試驗。

2.5 吐溫80對出芽短梗霉細胞脂肪酸組成的影響

吐溫80的添加對細胞脂肪酸組成成分的影響見表1。

表1 吐溫80的添加對細胞脂肪酸組成成分的影響Table 1 Fatty acid composition of A.pullulans cells grown with and without Tween 80

出芽短梗霉細胞含有的脂肪酸主要有棕櫚酸（C16：0），棕櫚油酸（C16：1），硬脂酸（C18：0），油酸（C18：1），亞油酸（C18：2）。在吐溫 80 存在的情況下，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例從2.11上升到了2.85，比重提高了25.96%。脂肪酸不飽和度的提升主要是因為棕櫚酸含量的下降以及亞油酸含量的增加。

脂肪酸不飽和鍵的含量和鏈長會影響細胞膜的流動性，不飽和鍵含量越高，膜脂的流動性和通透性就會越大。細胞膜的通透性的增強，更加有利于菌體細胞從周圍環(huán)境中攝入營養(yǎng)物質(zhì)，同時使得胞內(nèi)物質(zhì)更加容易的往胞外分泌[15-16]。

2.6 吐溫80對出芽短梗霉細胞膜通透性的影響

利用流式細胞儀測定碘化丙啶（PI）染色的細胞熒光強度的變化，考察了吐溫80對細胞膜通透性的影響。熒光染料PI是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色[14]，流式細胞儀檢測吐溫80對細胞膜通透性的影響見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測吐溫80對細胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of Tween-80 on cell membrane permeability of A.pullulans assessed by flow cytometry

通過差速離心法去除碳酸鈣，收集菌體細胞，加入PI染色液，暗反應30 min后進行檢測。從圖5中可以看出，出芽短梗霉在不同發(fā)酵條件下熒光強度是不同的。空白組熒光強度平均值為8.74，試驗組熒光強度平均值為12.19，熒光強度提高了39.47%。試驗組熒光強度高于空白對照組，說明加入吐溫80使得菌體細胞膜的通透性得到了提高。

2.7 吐溫80對出芽短梗霉細胞膜結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果圖見圖6。

在添加和不添加2 g/L吐溫80的情況下，利用透射電鏡觀察了出芽短梗霉的細胞膜的結(jié)構(gòu)。由圖6可知，在添加吐溫80的情況下細胞膜的結(jié)構(gòu)與不添加時是有明顯的差異的。空白組中，細胞膜是規(guī)則的、清晰的、圓潤緊湊的。試驗組中，細胞膜是不規(guī)則的、松散的，有一定程度的內(nèi)凹和折疊，并且能夠觀察到微小空洞的出現(xiàn)。出芽短梗霉細胞膜形態(tài)發(fā)生變化可能是因為吐溫80與膜磷脂雙分子中的脂質(zhì)部分發(fā)生了相互作用[10]。

圖6 透射電鏡結(jié)果圖Fig.6 Transmission electron microscope results

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)不同表面活性劑對出芽短梗霉生長和PMLA生產(chǎn)的影響各不相同，SDS和曲拉通X-100對PMLA的合成有抑制作用，不利于PMLA的合成。吐溫80和吐溫60在低濃度時有利于PMLA的合成，最適添加量都是2 g/L，吐溫80比吐溫60的作用效果更好。添加吐溫80后，PMLA的產(chǎn)量為31.36 g/L，較對照組提高了30.5%。選擇吐溫80作為最佳影響因子時，胞內(nèi)脂肪酸含量檢測結(jié)果顯示，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比率提高，這使得細胞膜的流動性增強；同時細胞膜結(jié)構(gòu)變得松散，通透性增強，有利于PMLA往胞外分泌。