王艷麗，李靜，高品，王璐瑤，王建新，鄭滿榮，呂曉玲

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

花色苷（anthocyanins），是一種天然、安全、無毒的 色素，具有抗氧化、抑制炎癥、預(yù)防慢性病以及改善視力等生物學(xué)作用[1]，而紫甘薯（purple sweet potato）是一種富含花青素的食物[2]。紫甘薯花色苷是保健食品，醫(yī)藥、化工制造業(yè)的重要原料。近年來，隨著人類微生物組計(jì)劃（The Human Microbiome Project，HMP）的展開，人類越來越意識到宿主的健康與腸道菌群有著密切的關(guān)系[3]，對腸道微生物相關(guān)的研究空前關(guān)注。腸道菌群與人體的健康也是密不可分的，菌群失調(diào)會(huì)引起諸多疾病，如2型糖尿病、肥胖、腸炎、慢性肝炎等。研究腸道菌與花色苷的相互作用，有利于了解食物成分花色苷對腸道菌群與人體的共生關(guān)系的影響，為健康食品的開發(fā)提供依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

紫甘薯花色苷提取物（花色苷含量以通用的矢車菊-3-葡萄糖苷計(jì)為15.59%，紫甘薯花色苷分子量一般在900 g/mol～1 200 g/mol，實(shí)際花色苷含量折算大約為40%；色價(jià)83.45）：葫蘆島茂華生物有限責(zé)任公司。

大腸桿菌：取自健康成年女性（2個(gè)月內(nèi)未服用抗生素和任何乳桿菌制劑，包括酸奶）糞便，經(jīng)分離鑒定。

1.1.2 試劑

伊紅美藍(lán)瓊脂（eosin-methylene blue agar，EMB）：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)液（胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、氯化鈉10 g/L，調(diào)整pH值為7.0～7.2）；酵母膏、胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙腈（分析純）、二甲基叔丁醚（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇（分析純）、三氟乙酸（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-300-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱、YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LC-20高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、LCMS-IT-TOF離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：日本島津公司；TBE300C高速逆流色譜儀（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）：上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌菌體活化

將已經(jīng)活化好的發(fā)酵液，進(jìn)行梯度稀釋后，用平板計(jì)數(shù)法測定活菌體個(gè)數(shù)，使其發(fā)酵液濃度在9.0×1012cfu/mL。

1.3.2 紫甘薯花色苷對中性菌大腸桿菌體外增殖的抑制作用

采用濾紙片測試培養(yǎng)法[5]，測定紫甘薯花色苷對中性菌大腸桿菌抑制作用。以水為空白對照，配制紫甘薯花色苷質(zhì)量濃度為 3.2、6.4、9.6、12.8 mg/mL的水溶液。將滅菌后的6 mm濾紙片浸入無菌蒸餾水及其4種不同濃度的紫甘薯花色苷溶液中，無菌室內(nèi)浸泡2 h，令其充分吸收。通風(fēng)晾干，無菌條件下，將浸泡好的濾紙片貼在已涂布好的供試菌種的平板上，每個(gè)平板貼2片。將培養(yǎng)皿倒置37℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑。每個(gè)濃度做2個(gè)平行。

1.3.3 HSCCC溶劑體系的選擇

在50 mL離心管中將不同溶劑按比例配置上下相，充分混合后分層，分別取4 mL上相和下相，分別裝入另外兩個(gè)干凈的10 mL離心管中。將少量的花色苷提取物加入下相，溶解后取1 mL，用HPLC檢測，記為C1。在剩余的含有花色苷的下相中加入3mL的上相。充分混合后再取1 mL下相，用HPLC檢測，含量記為C2。

當(dāng)兩相平衡后，花色苷在上下相的分配系數(shù)=被分離物質(zhì)在上相中的含量/在下相中的含量，即在兩相中分配系數(shù)。據(jù)K值選擇合適的溶劑體系作為HSCCC的固定相和流動(dòng)相。

1.3.4 HSCCC制備分離純化單體花色苷

分離純化紫甘薯花色苷采用HSCCC方法，以二甲基叔丁醚∶正丁醇∶乙腈∶水∶三氟乙酸（2∶5∶1∶6∶0.01，體積比）為溶劑體系，固定相為上相，流動(dòng)相為下相，采用正接正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為850 r/min，溫度25℃，檢測波長為520 nm，流速1 mL/min。將花色苷提取物200 mg溶于15 mL下相溶劑中，注入高速逆流進(jìn)樣器。根據(jù)峰形手動(dòng)收集大約在72 min～78 min流出液組分4，將流出液進(jìn)行旋蒸后，-40℃減壓濃縮冷凍干燥24 h。之后，-80℃冰箱保存，待鑒定。

1.3.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源ESI，正離子掃描模式，干燥氣溫度350℃，氮?dú)饬魉?.5L/min，干燥器壓力133.0kPa，噴射電壓：4 kV，掃描一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜。

1.3.6 腸道緩沖液的配制

腸道緩沖液的配制，其主要參考Fleschhut等[6]研究的方法，是由還原性基質(zhì)、微量元素混合液和磷酸緩沖液組成，見表1。

表1 腸道緩沖液成分Table 1 The component of intestinal buffer solution

1.3.7 大腸桿菌對單體花色苷的作用

花色苷溶液配制：稱取25 mg單體花色苷溶于0.5 mL無菌超純水中，配制成母液質(zhì)量濃度為5mg/mL，花色苷最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。吸取0.2 mL的腸道緩沖液加入無菌2 mL離心管中，依次加入0.3 mL大腸桿菌發(fā)酵液和100 μL的單體花色苷過濾液（花色苷需經(jīng)0.22 μm水相膜過膜處理）。體外模擬腸道環(huán)境，放置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以LB培養(yǎng)液為空白對照，分別在 0、1、5 h 取樣，立即加入 50 μL 磷酸/水（17/3，體積比）溶液阻止花色苷的降解，使其pH值在3.8～4.1之間。

1.3.8 花色苷產(chǎn)物檢測

產(chǎn)物采用HPLC法在波長520 nm和280 nm下進(jìn)行檢測，將待測液經(jīng)0.22 μm過膜后，取濾液20 μL，進(jìn)樣。ZORBAX SB-C18色譜柱，柱溫控制在30℃，流動(dòng)相A：0.2%磷酸水溶液；流動(dòng)相B：純乙腈，線性梯度洗脫；0～30 min，B 液從 15%升至 25%；30 min～32 min，B 液從 25%降至 15%；32 min～35 min，B 液保持15%。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件，采用Origin9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯花色苷對大腸桿菌體外增殖的抑制作用

采用濾紙片法，研究紫甘薯花色苷對大腸桿菌體外增殖的抑制效果。不同濃度花青素作用下大腸桿菌抑菌圈直徑見表2。

表2 不同濃度花青素作用下大腸桿菌抑菌圈直徑Table 2 The inhibition zone diameter of Escherichia coli under different concentrations of anthocyanin

由表2可知，紫甘薯花色苷對大腸桿菌具有抑制作用，且抑菌圈直徑隨著紫甘薯花色苷質(zhì)量濃度的增加而增大，花色苷質(zhì)量濃度為12.8 mg/mL時(shí)抑菌圈直徑最大達(dá)到（9.20±0.26）mm。

紫甘薯花色苷對大腸桿菌有一定的抑制作用，且抑菌效果隨著紫甘薯花色苷濃度的增加而增加，呈正比。相對于古榮鑫等[7]研究的花青素濃度達(dá)到5 mg/mL，大腸桿菌完全被抑制，本研究抑菌效果要小很多；同時(shí)也比陳嬋等[8]研究的紫甘薯原花青素質(zhì)量濃度在10.5 mg/mL時(shí)，抑制大腸桿菌抑菌圈直徑能達(dá)15.5 mm也要小。這可能與品種、試驗(yàn)差別、生長時(shí)間等不同有關(guān)系。韓永斌等[9]研究顯示，花色苷的抑菌性是因?yàn)橛绊懥舜竽c桿菌細(xì)胞壁的通透性，花色苷分子上的眾多酚羥基與酶或者蛋白質(zhì)通過氫鍵方式結(jié)合，破壞了膜蛋白質(zhì)的合成，造成細(xì)胞質(zhì)流失，從而導(dǎo)致了細(xì)胞通透性增強(qiáng)，使得細(xì)胞無法生存。

2.2 HSCCC法分離制備芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷

2.2.1 HSCCC溶劑體系的選擇

溶劑體系的選擇，要求溶劑體系兩相間能快速明顯地分層，與被分離物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，樣品能在溶劑體系中很好的溶解，并使其在兩相間的分配系數(shù)K在0.5～2之間，且樣品中不同化合物的分配系數(shù)比大于1.5。有較高的固定相保留值（不小于40%），這樣快速能夠保證有效的分離。紫甘薯花色苷不同溶劑體系的分配系數(shù)見表3。

表3 紫甘薯花色苷不同溶劑體系的分配系數(shù)（K）Table 3 Partition coefficient（K）of different solvent systems of purple sweet potato anthocyanins

由表3可知，編號1、3、5溶劑體系中，被分離組分3的分配系數(shù)超過2；編號2、4溶劑體系中，組分1的分配系數(shù)過小，不能很好的分離，故選擇編號6溶劑體系2∶5∶1∶6∶0.01的溶劑體系進(jìn)行紫甘薯花色苷的分離[10]。圖1為高速逆流制備紫甘薯花色苷的組分。

2.2.2 花色苷單體結(jié)構(gòu)鑒定

花色苷單體的結(jié)構(gòu)鑒定采用液質(zhì)聯(lián)用在正離子模式下，進(jìn)行一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜分析，通過色譜保留時(shí)間、紫外最大吸收波長并結(jié)合組分質(zhì)譜的分子離子峰和碎片離子峰與Truong V D等[11-12]的鑒定結(jié)果進(jìn)行比對驗(yàn)證，組分4分子離子1 125 m/z，碎片離子301，463，963，保留時(shí)間 18.25 min，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）鑒定推測為芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷。

組分4的液相色譜圖見圖2，峰5為芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡糖苷，含量為75%。

圖1 高速逆流制備紫甘薯花色苷組分圖Fig.1 The composition of anthocyanin in purple sweet potato was prepared by HSCCC

2.3 大腸桿菌對芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷降解作用機(jī)理初探

圖2 組分4液相色譜圖Fig.2 The HPLC diagram of component 4

2.3.1 采用HPLC（檢測波長520 nm）法分析大腸桿菌對芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷（簡稱單體花色苷）的作用

檢測波長在520 nm下，大腸桿菌作用過程中單體花色苷峰面積變化如圖3所示。

圖3 大腸桿菌作用過程中單體花色苷峰面積變化Fig.3 Changes in the area of the monomeric anthocyanin peaks in the Escherichia coli

由圖3可以看出，520 nm下，隨著時(shí)間的延長，單體花色苷的含量在逐漸降低；在其他條件相同的情況下，試驗(yàn)組單體花色苷含量的降低程度明顯比空白組大，這說明大腸桿菌對單體花色苷有促進(jìn)降解的作用。隨著時(shí)間的延長，紫甘薯單體花色苷峰面積呈逐漸降低的趨勢，也就是說紫甘薯單體花色苷的含量降低了，5 h時(shí)，相比空白組，降低最明顯。

2.3.2 采用HPLC（檢測波長520 nm和280 nm）法推測大腸桿菌對單體花色苷降解作用機(jī)理

大腸桿菌對單體花色苷的作用液相色譜圖（檢測波長280 nm）如圖4，大腸桿菌對單體花色苷作用（檢測波長280 nm與520 nm下）對比液相色譜圖如圖5所示。

在520 nm可見光區(qū)下，由圖5分析可知，與大腸桿菌作用的單體花色苷峰面積逐漸降低，說明花色苷含量降低了，花色苷結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生了降解反應(yīng)，但沒有新峰出現(xiàn)，說明沒有形成新的有色降解產(chǎn)物。而在280 nm紫外光區(qū)下，圖4可知，一是單體花色苷出峰位置有吸收峰且峰面積基本沒有變化，說明花色苷分子量沒有發(fā)生顯著變化，而且分子中具有紫外吸收的芳香環(huán)沒有被破壞。二是單體花色苷的出峰位置沒有變化，說明分子沒有降解成更小的分子，也就是說沒有發(fā)生水解或者裂解等反應(yīng)，整個(gè)分子沒有斷裂，但有可能個(gè)別的鍵打開了，花色苷呈色基團(tuán)發(fā)生了改變，變成了沒有顏色的降解產(chǎn)物。

圖4 大腸桿菌對單體花色苷的作用液相圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of the effect of monomeric anthocyanin by Escherichia coli

整體從HPLC（280 nm與520 nm）檢測結(jié)果分析，說明花色苷基團(tuán)可能出現(xiàn)開環(huán)現(xiàn)象，沒有了呈現(xiàn)顏色的基團(tuán)?？赡苡伤{(lán)色或紫色的醌型堿轉(zhuǎn)變成部分無色的甲醇假堿形式，隨著時(shí)間延長，變成這種甲醇假堿形式的基團(tuán)逐漸增多，所以在圖中520 nm下呈現(xiàn)的顯色基團(tuán)含量就下降了許多。

圖5 試驗(yàn)組中大腸桿菌對花色苷作用對比液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of the effect of monomeric anthocyanin by Escherichia coli

關(guān)于花色苷目前可能降解的途徑一般包含以下3種：第一種是花色苷發(fā)生加成反應(yīng)，也就是水加成的過程，然后C-O鍵結(jié)構(gòu)發(fā)生開環(huán)，生成中間產(chǎn)物查爾酮類糖苷，進(jìn)而最終降解為香豆素類衍生物；第二種是在第一種生成查爾酮類糖苷后，發(fā)生水解反應(yīng)，糖苷被水解掉，剩下查爾酮，最終降解為苯甲酸類衍生物；第三種是花色苷經(jīng)水解脫去本身帶的單糖葡萄糖，生成糖苷配基，進(jìn)而生成α-二酮，而α-二酮屬于不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，所以繼續(xù)降解，降解為醛和苯甲酸衍生物[13]，而?；幕ㄉ找部梢运馊ヵ；蔀榉酋；幕ㄉ?。

本試驗(yàn)中大腸桿菌對單體花色苷降解的途徑可能是第一種或者第二種。所以，大腸桿菌對芍藥素-3-咖啡酰-阿魏?；碧擒?5-葡糖苷有降解作用，但在5 h之內(nèi)，還沒有出現(xiàn)進(jìn)一步的峰值變化，也就是說大腸桿菌只能對其起到開環(huán)作用，但沒有進(jìn)一步反應(yīng)，也沒有發(fā)生去?；饔?。這可能是盡管體外在模擬腸道環(huán)境，也無法達(dá)到與腸道微生物環(huán)境相同的程度。因?yàn)槌四c道菌，腸道中可能還有其他物質(zhì)影響對膳食多酚的作用。有研究表明，有些谷物類食品需要在結(jié)腸發(fā)酵中，細(xì)胞壁多糖阿魏酸酯才能在多糖水解酶作用下降解成可溶性的寡聚糖阿魏酸酯[14]，進(jìn)而在雙歧桿菌等腸道微生物所產(chǎn)酯酶的催化下形成游離阿魏酸，也就是說在體外還無法達(dá)到相同的效果。

3 討論與結(jié)論

1）采用濾紙片法對紫甘薯花色苷的抑菌活性進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，紫甘薯花色苷對大腸桿菌生長具有一定的抑制作用，抑菌作用強(qiáng)度隨著花色苷濃度的增加而增加。

2）利用高速逆流色譜法，從紫甘薯提取物中分離組分4單體花色苷，鑒定為：芍藥素-3-咖啡酰-阿魏酰槐糖苷-5-葡糖苷，含量為75%。通過HPLC（520 nm和280 nm）比較分析法，研究大腸桿菌對該單體花色苷的作用。表明在本研究的時(shí)間范圍內(nèi)，大腸桿菌的作用沒有使花色苷發(fā)生水解或者裂解等反應(yīng)，即沒有被降解成更小的分子。分子中呈現(xiàn)紫外吸收的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)并沒有被整體破壞，只是花色苷呈色基團(tuán)發(fā)生了改變，形成了沒有顏色的降解產(chǎn)物。