李 歡 ，劉睿娜 ，張思若 ，袁 璐 ，徐紀(jì)茹

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西西安710061；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安710061）

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷方法較多，但利用微生物學(xué)方法推斷PMI相對(duì)很少。死亡微生物組[1-7]是一個(gè)相對(duì)較新的名詞，是對(duì)動(dòng)物死后定植于內(nèi)臟與孔道的微生物群的研究。由于微生物在人死后尸體腐爛整個(gè)過(guò)程中呈現(xiàn)連續(xù)、不間斷的變化（種類(lèi)、數(shù)量、位置等），可以用于PMI的推斷。有研究結(jié)果[8]顯示，在腐敗過(guò)程中，變形菌門(mén)（丙型變形菌綱）在口腔和直腸中成為主要的門(mén)類(lèi)，而厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在口腔和直腸都減少，與直腸相比較而言，活鼠的口腔微生物群落結(jié)構(gòu)與立即死亡的SD大鼠之間有顯著不同。該研究結(jié)果表明，微生物群落可以估算“微生物鐘”。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于死亡微生物組的研究，所選擇標(biāo)本的來(lái)源除了人的尸體以外，還有豬[9-14]或者幼小的嚙齒類(lèi)動(dòng)物[11-12，15]的尸體。本研究旨在探索大鼠死后腸道菌群在不同時(shí)間點(diǎn)的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

雄性SD健康大鼠3只，體質(zhì)量 200～220 g，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并獲動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑

一次性無(wú)菌棉簽拭子（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司），C1000 TouchTMThermal Cycler PCR 儀、DCodeTM變性凝膠電泳儀、Gel DocTM2000凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），InGenius3 Gel Documentation System成像儀（英國(guó)Syngene公司），糞便基因組DNA提取試劑盒［DP328-02，天根生化科技（北京）有限公司］，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴化乙啶（ethidium bromide，EB）、DL2000 DNA標(biāo)記（日本TaKaRa公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 收集標(biāo)本

3只大鼠于鼠籠中置于室內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周，不做任何干預(yù)（編號(hào)A、B、C），允許昆蟲(chóng)接觸。頸椎脫臼處死后置于室內(nèi)［平均溫度為（8.22±3.04）℃，濕度為20%～30%］提前準(zhǔn)備的鼠籠中，用無(wú)菌棉簽蘸取無(wú)菌生理鹽水擦拭直腸60 s[12]，分別于處死后第 1、5、10、15、20、25、30天收集腸道菌群標(biāo)本，觀察尸體隨時(shí)間的變化情況，并按照新鮮期、膨脹期、腐爛活躍期、腐爛晚期和干腐期[13-14]進(jìn)行分類(lèi)。

1.3.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

（1）DNA提取。應(yīng)用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品中菌群總DNA。

（2）DNA 擴(kuò)增。 利用 C1000 TouchTMThermal Cycler PCR儀擴(kuò)增所得DNA產(chǎn)物，第一輪選擇引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）擴(kuò)增16S rRNA基因，第二輪選擇細(xì)菌16S rRNA-V3區(qū)通用引物534R（5′-ATTACCGCGGCTGCTG-3′）和 GC 夾（5′-CGCCCG CCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′）的 341F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）擴(kuò)增16S rRNA V3區(qū)。第一輪PCR體系為25 μL，包含2.5 μL MgCl2（25 mmol/L）、2.5 μL 10×緩沖液、dNTP 0.5μL、上下游引物各 0.5μL（均為 10mmol/L）、0.2μL Taq DNA 聚合酶（日本 TaKaRa公司）、4 μL 的 DNA模板（細(xì)菌基因組DNA）、14.3 μL H2O。反應(yīng)程序：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，4℃恒溫保持。第二輪PCR體系為50 μL，包含 5 μL MgCl2（25 mmol/L）、5 μL 10×緩沖液、上下游引物各 1 μL（10 μmol/L）、1 μL 的 dNTP混合物（均為 10 mmol/L）、0.4 μL Taq DNA 聚合酶（5U/μL，日本 TaKaRa 公司）、4μL DNA 模板、32.6μL H2O。采用“touchdown”反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃40 s，65℃ 40 s，72℃ 1 min；退火溫度每?jī)蓚€(gè)循環(huán)下降1℃，直至溫度下降到55℃，在此溫度再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，最終72℃ 10min，4℃恒溫保持。PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠、100V電壓電泳50min驗(yàn)證，EB染色15 min，InGenius3 Gel Documentation System 成像儀觀察凝膠電泳結(jié)果。

（3）變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）指紋圖譜分析。擴(kuò)增產(chǎn)物使用DCodeTM變性凝膠電泳儀進(jìn)行指紋圖譜分析，PCR片段由8%聚丙烯酰胺凝膠電泳在1×TAE緩沖液中分離。聚丙烯酰胺包含30%～65%線性變性梯度：30%的變性劑（100mL）包含 40%雙丙烯酰胺 20mL，50×TAE緩沖液2mL、甲酰胺12 mL、尿素12.6 g，超純水定容到100mL。65%的變性劑（100mL）除甲酰胺（26mL）和尿素（27.3g）與30%的變性劑不同，其余試劑均不變。100%變性劑包含7.0 mol/L尿素和體積分?jǐn)?shù)為40%去離子甲酰胺。90V恒定電壓、1×TAE緩沖液保持 60℃，電泳 14 h，EB 染色 30 min，Gel DocTM2000凝膠成像儀獲得膠圖并完成標(biāo)記工作。

腸道菌群的多樣性利用Quantity One?1-D分析軟件（美國(guó)Bio-Rad公司）分析指紋圖譜中條帶數(shù)目、灰度值，采用微生物群落多樣性Shannon-Wiener指數(shù)（H’）分析腸道菌群細(xì)菌類(lèi)型的多樣性，公式如下[16]：

式中：H’為樣品的信息含量，即群落的多樣性指數(shù)；S為種數(shù)；Pi為樣品中屬于第i種的個(gè)體的比例，如樣品總個(gè)體數(shù)為N，第i種個(gè)體數(shù)為ni，則Pi=ni/N。利用Quantity One?1-D分析軟件對(duì)群落進(jìn)行非加權(quán)的配對(duì)分析（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）、聚類(lèi)分析，利用 Microsoft Excel計(jì)算Dice相似性系數(shù)（coefficient of similarity，Cs），并制作腸道菌群Cs累積曲線，x軸為樣本之間的Cs，y軸為所有小于或等于某特定Cs數(shù)值所占的百分比。利用SPSS 17.0計(jì)算組內(nèi)Cs，對(duì)7組的DGGE條帶數(shù)、H’值、組內(nèi)Cs進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）和 t檢驗(yàn)。 檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

1.3.3 條帶回收和切膠測(cè)序

在紫外線照射下，用干凈刀片仔細(xì)切下所選條帶（盡量去除多余的凝膠），采用膠回收試劑盒，獲取凝膠中DNA片段，溶解在Elution緩沖液中4℃保存。以回收的DNA為模板，再次PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系按照前述進(jìn)行。改用V3區(qū)通用（不需GC夾）引物V3-F：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′和 V3-R：5′-ATT ACCGCGGCTGCTGG-3′。擴(kuò)增程序改為普通PCR程序：95℃ 5min；95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃ 7min，4℃保存。

取PCR產(chǎn)物2μL，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，直接將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 尸體情況

本研究發(fā)現(xiàn)：大鼠尸體前4d未發(fā)生肉眼可見(jiàn)的明顯變化，歸為新鮮期；第5天開(kāi)始膨脹，5～6 d為膨脹期；第7天破裂，流出液體，7～8d為破裂期；第11天出現(xiàn)蛆蟲(chóng)，并逐漸增多，11～13d為腐爛活躍期，在腐敗菌作用下，尸體產(chǎn)生大量腐敗氣體，包括硫氫化物、甲烷、尸胺、腐胺[17]。隨著蛆蟲(chóng)的侵蝕以及自身水分的流失，第18天尸體變干，之后時(shí)間點(diǎn)歸到干腐期。

2.2 DGGE指紋圖譜分析

腸道菌群DGGE指紋圖譜如圖1、表1所示，其條帶數(shù)量、位置和亮度在不同樣本中呈現(xiàn)不同的特征。方差分析顯示，各組條帶數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明隨死亡時(shí)間的推移，腸道菌群種類(lèi)呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)：第1天菌群多樣性高于其他組；第 5、10、15、20、25、30 天的條帶數(shù)兩兩之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

方差分析顯示，各組間H’值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)：第1天與其他組的H’值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明第1天菌群種類(lèi)多于其他組。 第 5、10、15、20、25、30 天的條帶數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 DGGE指紋圖譜

表1 DGGE指紋圖譜相似性與多樣性分析 （n=3，±s）

表1 DGGE指紋圖譜相似性與多樣性分析 （n=3，±s）

注：1）第 5、10、15、20、25、30 天兩兩比較，P 均＜0.05；2）與第 1 天比較，P＜0.05；3）與第 5 天比較，P＜0.05；4）7 組間組內(nèi)比較

時(shí)間/d 細(xì)菌多樣性 組內(nèi)Cs/%DGGE 條帶數(shù)/條1） H’1）1 30.00±5.35 3.40±0.18 47.20±10.29 5 18.00±4.352） 3.21±0.472） 40.72±10.292）10 14.67±3.792） 2.66±0.252） 27.37±9.752）15 15.00±1.732） 2.70±0.112） 30.84±11.542）20 14.33±1.152） 2.66±0.082） 25.58±10.292）25 11.00±1.002） 2.40±0.092） 22.43±10.002）3）30 10.33±2.082） 2.32±0.212） 24.43±13.962）3）P 值 4） 0.015 0.013 0.000

組內(nèi)Cs的方差分析顯示，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組組內(nèi)Cs的兩兩比較發(fā)現(xiàn)：第1天與其他組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第5天和第25、30天的組內(nèi)Cs之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其他組間的兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果（圖2）顯示，7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠腸道菌群聚集為3個(gè)主要分支：第1天聚集在最下支，第 5、10、15 天聚集于中間支，第 20、25、30 天聚集于最上支。有些時(shí)間點(diǎn)存在交叉，同一天的樣本至少有兩個(gè)聚集在了一起（除外30天）。Cs累積分布曲線（圖3）顯示：第1天個(gè)體之間相似性最高，第30天最低（曲線越靠近X軸，組內(nèi)相似性越高）；除第15天，隨著死亡時(shí)間推移各組個(gè)體之間相似性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 DGGE指紋圖譜聚類(lèi)分析（基于Cs的UPGMA分析）

圖3 大鼠處死后腸道菌群Cs累積曲線

2.3 DGGE指紋圖譜條帶切膠測(cè)序和測(cè)序比對(duì)結(jié)果

從圖4可以看出，處死后第1天菌群種類(lèi)明顯多于其他時(shí)間組。處死后第1、5天大鼠腸道菌群以腸球菌屬（Enterococcus sp.）為主；處死后第 10、15、20 天以蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）為主，松鼠葡萄球菌（Staphycococcus sciuri）消失；處死后第 25、30天以糞腸球菌（Enterococcus faecalis）為主。

圖4 處死后大鼠腸道菌群分布

3 討 論

微生物的研究至今主要致力于共生菌和病原菌，以促進(jìn)人類(lèi)健康，但是對(duì)于宿主死后微生物的連續(xù)變化卻知之甚少。在成人腸道中，微生物數(shù)量可達(dá)1012～1014個(gè)，細(xì)菌的種類(lèi)達(dá)1 000多種。宿主死亡后其尸體的降解各個(gè)環(huán)節(jié)都有微生物的參與，除外其固有菌，隨PMI的延續(xù)，腸道、皮膚以及其他組織器官菌群的多少、種類(lèi)、組成結(jié)構(gòu)都可能發(fā)生顯著變化，并且菌群也會(huì)隨環(huán)境，如溫度、濕度、pH值等條件的變化而變化，從而對(duì)尸體的腐敗發(fā)揮不同的作用。本研究利用DGGE對(duì)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為不同，將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開(kāi)，檢測(cè)片段大小在500bp（本研究DNA片段為196bp）以內(nèi)，以檢測(cè)優(yōu)勢(shì)菌群[14]。

本研究結(jié)果顯示，厚壁菌門(mén)為主要門(mén)類(lèi)，與以往研究[8]腐敗過(guò)程中以變形菌門(mén)為主不同。本研究的溫度［（8.22±3.04） ℃］、濕度（20%～30%），與文獻(xiàn)[8]中的溫度（22.71～27.67℃）、濕度（60.29%～89.38%）相差甚遠(yuǎn)，這兩個(gè)因素對(duì)菌群的種類(lèi)有很大的影響。

處死大鼠腸道菌群不同時(shí)間點(diǎn)多樣性具有顯著差異，表明大鼠處死后不同時(shí)間點(diǎn)之間腸道菌群都有各自組成特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特征，也表明腸道菌群用來(lái)估算PMI是可行的，印證和拓展了以往研究[1，8]。大鼠處死后腸道菌群多樣性除第15天外均隨時(shí)間推移呈遞減趨勢(shì)。第15天的突然增長(zhǎng)或許是因?yàn)椋海?）外界環(huán)境條件的變化，如溫度、濕度等；（2）取樣污染；（3）大鼠尸體自身發(fā)生的變化所致。

本研究 UPGMA 聚類(lèi)分析時(shí)，第 10、15、20、30 天組內(nèi)樣本未完全聚集，究其原因可能是因?yàn)椋海?）Quantity One?1-D分析軟件對(duì)DGGE圖譜的分析存在諸多不確定因素，如對(duì)條帶自動(dòng)識(shí)別時(shí)，比較亮的條帶可以識(shí)別，但對(duì)亮度不夠的條帶則不能識(shí)別，此時(shí)便需要人為添加，腸道菌群種類(lèi)繁多，呈現(xiàn)在圖譜中的條帶數(shù)量很大，人為不能將所有的條帶都進(jìn)行標(biāo)記，便會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏倚。（2）比對(duì)不同泳道同一位置條帶時(shí)，也需要人為調(diào)節(jié)，容易產(chǎn)生誤差。所以，DGGE圖譜的分析結(jié)果提示了大致的變化趨勢(shì)，準(zhǔn)確的方法需要依靠高通量測(cè)序。

目前，PMI推斷仍是法醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題，法醫(yī)學(xué)者推斷PMI的方法[18]包括分子生物學(xué)、光譜學(xué)、昆蟲(chóng)學(xué)、死亡化學(xué)等，但仍未實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確推斷PMI的目的。本研究通過(guò)對(duì)處死后大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腸道菌群多樣性、相似性、變化規(guī)律以及不同時(shí)間段大致的菌屬組成進(jìn)行分析，表面腸道菌群作為推斷PMI的“微生物鐘”是可行的。隨著研究的不斷深入，若可以發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)不同的菌屬便可將其作為該時(shí)間點(diǎn)的生物標(biāo)記。

本研究雖然揭示了大鼠死后腸道菌群變化的規(guī)律，但由于采樣點(diǎn)選取、一代測(cè)序技術(shù)的局限以及切膠處理、比對(duì)的誤差，并未得到所有細(xì)菌在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組成結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果為以后進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ)，也對(duì)后期進(jìn)一步研究有所啟發(fā)。例如，除腸道外，還可以增加皮膚、口腔等部位的菌群樣本，以尋找最能體現(xiàn)死亡時(shí)間的特征菌群，在此基礎(chǔ)上增加時(shí)間點(diǎn)和樣本數(shù)量，提高PMI推斷的準(zhǔn)確性。