孫佳勝 ，田慶花 ，趙 霖 ，王俊方 ，畢 潔 ，石美森

（1.長沙市公安局刑事偵查支隊(duì)技術(shù)大隊(duì)，湖南 長沙 410000；2.中國政法大學(xué) 證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088；3.北京明正司法鑒定中心，北京 100191）

短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）序列，由于具有豐富的多態(tài)性，被廣泛地用于連鎖分析、個(gè)體識別、群體遺傳學(xué)分析以及人類進(jìn)化史的研究[1-3]。本研究應(yīng)用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)BASIC對2004份長沙漢族個(gè)體共18個(gè)常染色體STR基因座進(jìn)行遺傳多態(tài)性調(diào)查，旨在為長沙地區(qū)的親權(quán)鑒定和個(gè)體識別提供更為準(zhǔn)確的概率計(jì)算依據(jù)，同時(shí)運(yùn)用該數(shù)據(jù)和有關(guān)文獻(xiàn)探討長沙漢族和其他群體的遺傳關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本

根據(jù)“知情同意”原則，通過湖南省長沙市公安局DNA數(shù)據(jù)庫，選取長沙市各類案件中的涉案人員中無親緣關(guān)系個(gè)體2 004名（其中男性997名，女性1007名）。取血樣置于FTA采血卡上（武漢驥騰生物科技有限公司），干燥后常溫保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用打孔器打取直徑為1.2 mm的血樣，利用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)BASIC［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］10μL體系進(jìn)行直接擴(kuò)增：PCR反應(yīng)緩沖液4μL，引物混合液2μL，Taq聚合酶 0.16μL，補(bǔ)水至10μL。采用9700型PCR儀（美國AB公司）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 1min，70℃ 1 min；28～30個(gè)循環(huán)；60℃ 60 min。 3130xl基因分析儀（美國AB公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用Gene-Mapper?ID v3.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行基因分型。檢測使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)9947（女性）的基因組DNA作為擴(kuò)增陽性對照，超純水作為陰性對照進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用Modified-Powerstats軟件[4]獲得各STR基因座的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)，如觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、個(gè)體識別率（discrimination power，DP）、多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）。 采用 Cervus 3.0（http://www.fieldgenetics.com/pages/Home.jsp）計(jì)算累積個(gè)體識別率（total probability of discrimination power，TDP）、三聯(lián)體非父排除率（probability of exclusion in trio cases，PEtrio）和二聯(lián)體非父排除率（probability of exclusion in duo cases，PEduo）。 采用 Arlequin v3.5 軟件（http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3.5）進(jìn)行各基因座Hardy-Weinberg平衡及連鎖不平衡檢驗(yàn)。Bonferroni法[5]進(jìn)行修正。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

通過文獻(xiàn)檢索獲得12個(gè)漢族地區(qū)［甘肅（272份）[6]、黑龍江大慶（221 份）[7]、貴州（1 104 份）[8]、廣東（1500 份）[9]、河北石家莊（323 份）[10]、四川（226 份）[11]、浙江（5000 份）[12]、江蘇（3097 份）[13]、重慶（180 份）[14]、山西（1 233 份）[15]、湖南（1 218 份）[16]、吉林長春（1775 份）[17]］和 7 個(gè)少數(shù)民族地區(qū)［廣西瑤族（70 份）[18]、廣西苗族（68 份）[18]、廣西壯族（223 份）[19]、云南傣族（100 份）[20]、廣西侗族（70 份）[20]、新疆維吾爾族（1 381 份）[21]、新疆哈薩克族（81 份）[21]］人群的 18 個(gè)STR基因座等位基因頻率作為群體遺傳關(guān)系比較的數(shù)據(jù)。應(yīng)用DISPAN軟件（http://www.personal.psu.edu/nxm2/software.htm）計(jì)算Nei的DA遺傳距離，Mega 7.0軟件（http://www.megasoftware.net/）構(gòu)建20個(gè)群體鄰接法（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 18個(gè)STR基因座的等位基因分型結(jié)果

在2 004份湖南長沙漢族無關(guān)個(gè)體的血樣中，Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)BASIC中的18個(gè)STR基因座都得到了有效擴(kuò)增，且各基因座間擴(kuò)增產(chǎn)物平衡，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度在85～428bp，純合子只顯現(xiàn)1個(gè)等位基因峰，雜合子則有2個(gè)等位基因峰且峰高比例＞70%。有效擴(kuò)增的18個(gè)STR基因座的等位基因及其頻率見表1。

2.2 18個(gè)STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)

采用 Bonferroni法修正，將 P值設(shè)為 0.002 8（0.05/18），18個(gè)STR基因座的基因型頻率分布在長沙漢族人群中均達(dá)到 Hardy-Weinberg平衡（P＞0.0028）。18個(gè)STR基因座兩兩之間共進(jìn)行153次連鎖不平衡檢驗(yàn)，其中有5次比較的結(jié)果P＜0.05，為 0.000 4～0.041 8，且位于不同的染色體上，采用Bonferroni法修正，將P值設(shè)為0.000 327（0.05/153），各位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象（P＞0.000 327）。群體遺傳學(xué)參數(shù)（表2）表明，18個(gè)STR基因座的基因型頻率分布在長沙漢族群體中達(dá)到Hardy-Weinberg遺傳平衡。長沙漢族各基因座 DP為0.783 6～0.987 9，PIC為 0.5494～0.9145。 18 個(gè) STR 基因座 TDP、CPEtrio和CPEduo分別為 0.999 999 999 999 999 999 999 865 2、0.999999979和 0.999988325。

2.3 長沙漢族與19個(gè)人群間的遺傳距離

根據(jù)本文獲得的長沙漢族人群18個(gè)STR基因座基因頻率數(shù)據(jù)，應(yīng)用DISPAN軟件計(jì)算與國內(nèi)目前公開發(fā)表的19個(gè)人群Nei的DA遺傳距離，并得到各群體間遺傳距離矩陣，見表3，應(yīng)用鄰接法所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

表1 長沙漢族18個(gè)STR基因座等位基因及等位基因頻率 （n=2004）

續(xù)表1

表2 長沙漢族18個(gè)STR基因座的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=2004）

圖1 20個(gè)人群NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

從表3和圖1可以看出，在12個(gè)漢族比較人群中，湖南長沙漢族與湖南漢族的遺傳距離最近（0.0141），其次是與浙江漢族（0.0148）、廣東漢族（0.0158）的距離較近，與黑龍江大慶漢族的遺傳距離最遠(yuǎn)（0.0345）。在7個(gè)少數(shù)民族人群中，湖南長沙漢族與廣西壯族的遺傳距離相對較近（0.0265），與新疆哈薩克族的遺傳距離相對最遠(yuǎn)（0.0418）。

3 討 論

STR基因座的遺傳多態(tài)性為人類遺傳學(xué)、群體遺傳學(xué)研究提供了可靠依據(jù)。目前，已經(jīng)有學(xué)者對我國不同民族或漢族亞群進(jìn)行了不同程度的研究，但研究對象多為單一民族，且選擇的遺傳標(biāo)記數(shù)量少、不統(tǒng)一[22-25]。本研究選擇收集包括本實(shí)驗(yàn)室及其他研究者所調(diào)查的Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)BASIC中的18個(gè)STR基因座的等位基因頻率，探討長沙漢族人群的遺傳多態(tài)性及其與19個(gè)群體之間的遺傳關(guān)系，保證所分析數(shù)據(jù)量豐富、遺傳標(biāo)記選擇及分析方法科學(xué)合理。

表3 20 個(gè)群體Nei 的DA遺傳距離矩陣

本研究表明，該18個(gè)STR基因座在長沙漢族人群中具有高度的遺傳多態(tài)性，可以滿足該地區(qū)法醫(yī)學(xué)中的親子鑒定和個(gè)體識別問題。

遺傳距離是評價(jià)群體間或物種間遺傳差異或遺傳分化的重要參數(shù)，根據(jù)所計(jì)算的遺傳距離繪制NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，漢族基本上聚為南北兩大類，與許麗娜等[3，26]的研究報(bào)道一致。長沙漢族大致位于南北漢族的中間位置，來自南方的漢族人群（浙江漢族、四川漢族、廣東漢族、湖南漢族、重慶漢族、貴州漢族）彼此分散聚在同一支；北方漢族人群（江蘇漢族、山西漢族、吉林長春漢族、河北石家莊漢族、甘肅漢族、黑龍江大慶漢族）彼此聚在一起，基本上與史料記載[27]相吻合。標(biāo)本來源和標(biāo)本均一性會(huì)對人群的聚類造成一定影響，江蘇漢族主要是針對蘇北地區(qū)人群的調(diào)查[13]，這也就解釋了江蘇漢族與北方人群聚類的原因。

在7個(gè)少數(shù)民族人群中，長沙漢族與廣西壯族的遺傳距離相對較近。廣西壯族與相鄰的漢族和少數(shù)民族關(guān)系較近的原因可能在于壯族是我國南方最大的少數(shù)民族，人口多，分布廣，與漢族及其他少數(shù)民族的基因交流要多于廣西其他少數(shù)民族。本研究結(jié)果顯示，廣西壯族和云南傣族十分靠近，聚為一支。廣西苗族、瑤族、侗族相聚在一起，說明他們遺傳結(jié)構(gòu)十分相似。新疆哈薩克族、新疆維吾爾族彼此間比較相近，與漢族和其他少數(shù)民族遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，可能與這兩個(gè)民族信仰伊斯蘭教，與漢族文化交融較少，甚少與其他民族通婚，因此積累著自己的祖系基因，與其他民族存在較大的遺傳差異所致。總體來看，根據(jù)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)BASIC中的18個(gè)STR基因座計(jì)算的遺傳距離與各民族群體的形成歷史較一致，說明常染色體STR遺傳標(biāo)記在民族間遺傳距離和基因漂流的評價(jià)中起到一定作用，但要確定某一群體與其他群體的關(guān)系，還有待于對Y染色體DNA、線粒體DNA等其他遺傳標(biāo)記以及考古學(xué)、人類學(xué)等的分析研究。

綜上，本研究獲得了長沙漢族人群18個(gè)STR基因座的等位基因頻率及基因型分布數(shù)據(jù)，為建立長沙地區(qū)漢族人群STR數(shù)據(jù)庫、群體遺傳關(guān)系的分析及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了良好的遺傳背景數(shù)據(jù)。