杜秋香 ,朱細(xì)燕 ,董塔娜 ,楊璨羽 ,孫俊紅
(1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,山西 晉中 030600;2.法醫(yī)學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 晉中 030600;3.陸軍軍醫(yī)大學(xué) 野戰(zhàn)外科研究所第四研究室 車(chē)輛/生物碰撞安全重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400042)
實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)mRNA在組織損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)已成為分子生物學(xué)的常用方法,mRNA的表達(dá)規(guī)律也已得到大多數(shù)法醫(yī)學(xué)家的關(guān)注并嘗試用于損傷時(shí)間推斷[1],但對(duì)這些指標(biāo)在不同個(gè)體間表達(dá)的同質(zhì)性及mRNA是否適用于損傷時(shí)間推斷缺乏系統(tǒng)研究。本課題組在檢測(cè)不同mRNA隨損傷時(shí)間的變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn),部分指標(biāo)在不同個(gè)體間的表達(dá)差異極大,而有的指標(biāo)個(gè)體差異性極小。本研究從高通量測(cè)序得到的差異基因中篩選參與調(diào)控功能的Pumilio 相關(guān)蛋白 2(Pumilio homolog 2,PUM2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1相關(guān)結(jié)合蛋白2(transforming growth factor-β activated kinase 1 binding protein 2,TAB2)、參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成的縫隙連接蛋白45(connexin 45,Cx45)和煙堿型乙酰膽堿受體 α1亞型(cholinergic receptor nicotinic alpha 1,CHRNA1)四個(gè)不同功能基因的mRNA,使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)大鼠骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中mRNA的表達(dá)情況并比較其個(gè)體間同質(zhì)性,旨在為損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)篩選提供參考。
健康成年雄性SD大鼠(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,并通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn))78只,10周齡,200g左右,隨機(jī)分為正常對(duì)照組和損傷后 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48h 組,每組 6 只。
動(dòng)物模型采用常規(guī)的自由落體法制作大鼠骨骼肌挫傷模型[2-4]。空腹12h后,用3%戊巴比妥鈉溶液(40mg/kg)麻醉大鼠。剔除其右后肢毛發(fā)后,再用脫毛劑(美國(guó)Carter-Wallace公司)清除殘余毛發(fā),右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置,用自制固定裝置將100g圓柱形重力錘從200cm高度自由落體打擊其長(zhǎng)內(nèi)收肌和股薄肌處??刂拼驌粞b置的穩(wěn)定性,使得打擊錘能夠按固定高度垂直擊打,打擊錘末端圓柱形鋼(半徑為14mm)與動(dòng)物相接觸。
模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為損傷處可見(jiàn)皮下出血和肌肉挫傷而無(wú)脛腓骨骨折。損傷后大鼠分籠飼養(yǎng)并給予充足的飼料和蒸餾水,保持墊料清潔,飼養(yǎng)環(huán)境22~25℃,正常光照(與損傷前一致)。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),按350mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉,處死大鼠。取損傷中心區(qū)1.5cm×1.5cm長(zhǎng)內(nèi)收肌和股薄肌處腫脹變紅的肌肉組織約50mg置于液氮中備用。
使用 RNAiso Plus(9108,日本 TaKaRa 公司)提取骨骼肌組織中的總RNA,InfiniteTMM200 pro酶標(biāo)儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)測(cè)量總RNA純度及濃度,D260/D280在1.8~2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用Agilent RNA 6000 Nano試劑盒和Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)(美國(guó)Agilent Technologies公司)檢測(cè)樣本中總RNA的完整性,RNA完整性指數(shù)(RNA integrity number,RIN)值大于7.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Prime-ScriptTMRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)配置10 μL反轉(zhuǎn)錄體系,反轉(zhuǎn)錄程序:37℃ 15 min,85℃5s。得到cDNA溶液。
1.3.1 探針及引物的設(shè)計(jì)
從 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank)獲得基因序列后,使用Allele ID 6.0軟件(美國(guó)Premier公司)設(shè)計(jì)并由上海英杰公司合成上下游引物和TaqMan熒光探針,RPL13和RPL32 mRNA作為雙內(nèi)參基因[5]。引物及探針的具體序列見(jiàn)表1。
表1 目的基因與內(nèi)參基因的引物和探針
續(xù)表1
1.3.2 RT-qPCR擴(kuò)增
用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)中的EASY Dilution稀釋cDNA溶液,配制成梯度濃度為 1∶50、1∶51、1∶52、1∶53 和 1∶54 的標(biāo)準(zhǔn)品。以梯度濃度cDNA為模板,進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,評(píng)判目的基因擴(kuò)增效率是否與內(nèi)參基因一致。整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組(不加入cDNA),每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)兩次。
超凈工作臺(tái)中,在冰盒上使用Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)配置25μL RT-qPCR擴(kuò)增體系,在Mx3000P qPCR系統(tǒng)(美國(guó)Agilent Technologies公司)中進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。 擴(kuò)增條件:95℃ 10 s,1 個(gè)循環(huán);95℃ 5 s,60℃40s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。
計(jì)算基于雙內(nèi)參基因的PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt法,±s)及變異系數(shù)(coefficient of variation,CV),用以下三種方法比較 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表達(dá)個(gè)體間的同質(zhì)性:
(1)評(píng)估每個(gè)時(shí)間點(diǎn) PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA表達(dá)量的CV中有無(wú)極值出現(xiàn)。
(2)求累積變異度。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),根據(jù)PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表達(dá)量的 CV,從小到大排序賦值 1、2、3、4分(若 CV 相同,取兩賦值的均值)。每個(gè)mRNA指標(biāo)得到13個(gè)分值,分值之和即為該mRNA指標(biāo)的累積變異度。
CVCV較小者變異度低,同質(zhì)性高。
從表 2 可見(jiàn):對(duì)照組和損傷后 4、8、12、20、24、28、36、40 h組的PUM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV較大,超過(guò)0.50;在對(duì)照組和損傷后32h、48h組,TAB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV較大,達(dá)到或超過(guò)0.50;在損傷后20h組,Cx45 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV也達(dá)到0.50;而CHRNA1 mRNA在所有損傷組的相對(duì)表達(dá)量CV均未超過(guò)0.50。
從表2可知,四個(gè)mRNA相對(duì)表達(dá)量的累積變異度從大到小分別為PUM2 mRNA、CHRNA1 mRNA、TAB2 mRNA、Cx45 mRNA。
從表3可知,CVCV從大到小分別為T(mén)AB2 mRNA、PUM2 mRNA、Cx45 mRNA、CHRNA1 mRNA,但各指標(biāo)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表3 PUM2、TAB2、Cx45和 CHRNA1 mRNA 的 CVCV (n=6)
RT-qPCR技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢測(cè)損傷后組織中mRNA的含量,而這種含量隨時(shí)間變化的規(guī)律即可應(yīng)用于損傷時(shí)間推斷[6]。組織損傷后多種基因的mRNA表達(dá)都會(huì)發(fā)生變化,細(xì)胞內(nèi)mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量主要由mRNA的合成速率和mRNA自身的半衰期兩個(gè)因素決定,但是近些年發(fā)現(xiàn)后者的貢獻(xiàn)更大,即mRNA穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA相對(duì)表達(dá)量起著決定作用[7-8]。若細(xì)胞內(nèi)某mRNA含量變化太快,即mRNA數(shù)據(jù)變異度大,則使用RT-qPCR在不同個(gè)體乃至同一個(gè)體中檢測(cè)該mRNA時(shí),得到的數(shù)據(jù)就可能不一致。mRNA作為推斷損傷時(shí)間的指標(biāo)時(shí),在相同處理?xiàng)l件下,mRNA數(shù)據(jù)是否均一關(guān)系到損傷時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性。若mRNA數(shù)據(jù)變異度大,則損傷時(shí)間推斷的窗口較大;若mRNA數(shù)據(jù)高度一致,則可以縮小損傷時(shí)間推斷的窗口。此外,有研究[9-10]指出,mRNA的表達(dá)在個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間變異過(guò)大,不利于損傷時(shí)間推斷。因此,尋找個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間變異較小的mRNA是利用mRNA推斷損傷時(shí)間要解決的首要問(wèn)題。
PUM2是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,能通過(guò)其特定的結(jié)構(gòu)域與mRNA靶向結(jié)合以阻斷翻譯起始復(fù)合物的形成,抑制靶基因的表達(dá)[11]。在骨骼肌中,PUM2調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的收縮[12]。TAB2在機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)控中主要促進(jìn)炎癥反應(yīng)及時(shí)有效地終止[13]。本研究中,TAB2 mRNA在骨骼肌損傷修復(fù)中的相對(duì)表達(dá)量降低,可能是因?yàn)樵趽p傷早期肌細(xì)胞主動(dòng)降低炎癥的抑制因素,增強(qiáng)炎癥反應(yīng),吞噬壞死、溶解的組織細(xì)胞,為后期骨骼肌的再生與重塑作準(zhǔn)備。Cx45是一種縫隙連接通道蛋白,參與電信號(hào)在細(xì)胞之間傳遞。處于發(fā)育階段的成肌細(xì)胞或損傷細(xì)胞中Cx45等縫隙連接蛋白的表達(dá)較多[14],縫隙連接蛋白參與肌細(xì)胞增殖、分化、聚集及融合,促進(jìn)骨骼肌組織損傷修復(fù)[15]。CHRNA1是煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)的重要亞型之一,可與AChR結(jié)合并激活后者,引起節(jié)神經(jīng)元和骨骼肌興奮[16]。本研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌損傷后 16、24、40、44、48h CHRNA1 mRNA 的表達(dá)上調(diào),可能是由于損傷骨骼肌內(nèi)CHRNA1也受到了形態(tài)或功能上的損害,細(xì)胞受到刺激后新合成CHRNA1 mRNA,為蛋白分子的合成作準(zhǔn)備。
本研究從CV極值的存在與否、累積變異度大小、CV的集中趨勢(shì)和離散趨勢(shì)三個(gè)角度,分析PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表達(dá)在個(gè)體間的同質(zhì)性大小。大鼠骨骼肌損傷48h內(nèi),PUM2、TAB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)較大CV,而Cx45、CHRNA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的CV較小,累積變異度從大到小分別為PUM2 mRNA、CHRNA1 mRNA、TAB2 mRNA和Cx45 mRNA,PUM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的CV比 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量高,但尚不能認(rèn)為 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA三者相對(duì)表達(dá)量之間存在差別。在一定程度上,CVCV也反映四個(gè)指標(biāo)在損傷后個(gè)體間mRNA表達(dá)的同質(zhì)性。SNK分析結(jié)果并不支持TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV的平均水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,所以進(jìn)一步分析CVCV發(fā)現(xiàn),另三個(gè)CVCV從大到小分別為 TAB2 mRNA、Cx45 mRNA、CHRNA1 mRNA。以上結(jié)果表明,在大鼠骨骼肌挫傷修復(fù)中,PUM2 mRNA的同質(zhì)性最低,TAB2 mRNA次之,Cx45 mRNA和CHRNA1 mRNA的同質(zhì)性較高。由此可見(jiàn),參與生物過(guò)程調(diào)控作用的PUM2 mRNA和TAB2 mRNA表達(dá)在不同生物個(gè)體間差異較大,而作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成的Cx45 mRNA和CHRNA1 mRNA在不同生物個(gè)體間表達(dá)差異較小。
綜上所述,參與生物過(guò)程調(diào)控作用的mRNA可能導(dǎo)致RT-qPCR在同一個(gè)體或不同個(gè)體間檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)不一致,即mRNA數(shù)據(jù)離散度大,同質(zhì)性低,而參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成的mRNA指標(biāo)同質(zhì)性較高,因此在篩選用于損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)時(shí)應(yīng)注意其功能分類(lèi)。