杜秋香 ，朱細(xì)燕 ，董塔娜 ，楊璨羽 ，孫俊紅

（1．山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.法醫(yī)學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中 030600；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué) 野戰(zhàn)外科研究所第四研究室 車(chē)輛/生物碰撞安全重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042）

實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)mRNA在組織損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)已成為分子生物學(xué)的常用方法，mRNA的表達(dá)規(guī)律也已得到大多數(shù)法醫(yī)學(xué)家的關(guān)注并嘗試用于損傷時(shí)間推斷[1]，但對(duì)這些指標(biāo)在不同個(gè)體間表達(dá)的同質(zhì)性及mRNA是否適用于損傷時(shí)間推斷缺乏系統(tǒng)研究。本課題組在檢測(cè)不同mRNA隨損傷時(shí)間的變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分指標(biāo)在不同個(gè)體間的表達(dá)差異極大，而有的指標(biāo)個(gè)體差異性極小。本研究從高通量測(cè)序得到的差異基因中篩選參與調(diào)控功能的Pumilio 相關(guān)蛋白 2（Pumilio homolog 2，PUM2）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1相關(guān)結(jié)合蛋白2（transforming growth factor-β activated kinase 1 binding protein 2，TAB2）、參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成的縫隙連接蛋白45（connexin 45，Cx45）和煙堿型乙酰膽堿受體 α1亞型（cholinergic receptor nicotinic alpha 1，CHRNA1）四個(gè)不同功能基因的mRNA，使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)大鼠骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中mRNA的表達(dá)情況并比較其個(gè)體間同質(zhì)性，旨在為損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備

健康成年雄性SD大鼠（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，并通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)）78只，10周齡，200g左右，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和損傷后 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48h 組，每組 6 只。

動(dòng)物模型采用常規(guī)的自由落體法制作大鼠骨骼肌挫傷模型[2-4]。空腹12h后，用3%戊巴比妥鈉溶液（40mg/kg）麻醉大鼠。剔除其右后肢毛發(fā)后，再用脫毛劑（美國(guó)Carter-Wallace公司）清除殘余毛發(fā)，右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用自制固定裝置將100g圓柱形重力錘從200cm高度自由落體打擊其長(zhǎng)內(nèi)收肌和股薄肌處?？刂拼驌粞b置的穩(wěn)定性，使得打擊錘能夠按固定高度垂直擊打，打擊錘末端圓柱形鋼（半徑為14mm）與動(dòng)物相接觸。

模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為損傷處可見(jiàn)皮下出血和肌肉挫傷而無(wú)脛腓骨骨折。損傷后大鼠分籠飼養(yǎng)并給予充足的飼料和蒸餾水，保持墊料清潔，飼養(yǎng)環(huán)境22～25℃，正常光照（與損傷前一致）。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，按350mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉，處死大鼠。取損傷中心區(qū)1.5cm×1.5cm長(zhǎng)內(nèi)收肌和股薄肌處腫脹變紅的肌肉組織約50mg置于液氮中備用。

1.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

使用 RNAiso Plus（9108，日本 TaKaRa 公司）提取骨骼肌組織中的總RNA，InfiniteTMM200 pro酶標(biāo)儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）測(cè)量總RNA純度及濃度，D260/D280在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用Agilent RNA 6000 Nano試劑盒和Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)（美國(guó)Agilent Technologies公司）檢測(cè)樣本中總RNA的完整性，RNA完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）值大于7.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Prime-ScriptTMRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）配置10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄程序：37℃ 15 min，85℃5s。得到cDNA溶液。

1.3 RT-qPCR擴(kuò)增

1.3.1 探針及引物的設(shè)計(jì)

從 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank）獲得基因序列后，使用Allele ID 6.0軟件（美國(guó)Premier公司）設(shè)計(jì)并由上海英杰公司合成上下游引物和TaqMan熒光探針，RPL13和RPL32 mRNA作為雙內(nèi)參基因[5]。引物及探針的具體序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因與內(nèi)參基因的引物和探針

續(xù)表1

1.3.2 RT-qPCR擴(kuò)增

用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）中的EASY Dilution稀釋cDNA溶液，配制成梯度濃度為 1∶50、1∶51、1∶52、1∶53 和 1∶54 的標(biāo)準(zhǔn)品。以梯度濃度cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)判目的基因擴(kuò)增效率是否與內(nèi)參基因一致。整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組（不加入cDNA），每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)兩次。

超凈工作臺(tái)中，在冰盒上使用Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）配置25μL RT-qPCR擴(kuò)增體系，在Mx3000P qPCR系統(tǒng)（美國(guó)Agilent Technologies公司）中進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。 擴(kuò)增條件：95℃ 10 s，1 個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃40s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)算基于雙內(nèi)參基因的PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt法，±s）及變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），用以下三種方法比較 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表達(dá)個(gè)體間的同質(zhì)性：

（1）評(píng)估每個(gè)時(shí)間點(diǎn) PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA表達(dá)量的CV中有無(wú)極值出現(xiàn)。

（2）求累積變異度。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表達(dá)量的 CV，從小到大排序賦值 1、2、3、4分（若 CV 相同，取兩賦值的均值）。每個(gè)mRNA指標(biāo)得到13個(gè)分值，分值之和即為該mRNA指標(biāo)的累積變異度。

CVCV較小者變異度低，同質(zhì)性高。

2 結(jié) 果

2.1 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的CV

從表 2 可見(jiàn)：對(duì)照組和損傷后 4、8、12、20、24、28、36、40 h組的PUM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV較大，超過(guò)0.50；在對(duì)照組和損傷后32h、48h組，TAB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV較大，達(dá)到或超過(guò)0.50；在損傷后20h組，Cx45 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV也達(dá)到0.50；而CHRNA1 mRNA在所有損傷組的相對(duì)表達(dá)量CV均未超過(guò)0.50。

2.2 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的累積變異度

從表2可知，四個(gè)mRNA相對(duì)表達(dá)量的累積變異度從大到小分別為PUM2 mRNA、CHRNA1 mRNA、TAB2 mRNA、Cx45 mRNA。

2.3 PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量CV的集中趨勢(shì)與離散趨勢(shì)

從表3可知，CVCV從大到小分別為T(mén)AB2 mRNA、PUM2 mRNA、Cx45 mRNA、CHRNA1 mRNA，但各指標(biāo)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 PUM2、TAB2、Cx45和 CHRNA1 mRNA 的 CVCV （n=6）

3 討 論

RT-qPCR技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢測(cè)損傷后組織中mRNA的含量，而這種含量隨時(shí)間變化的規(guī)律即可應(yīng)用于損傷時(shí)間推斷[6]。組織損傷后多種基因的mRNA表達(dá)都會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量主要由mRNA的合成速率和mRNA自身的半衰期兩個(gè)因素決定，但是近些年發(fā)現(xiàn)后者的貢獻(xiàn)更大，即mRNA穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA相對(duì)表達(dá)量起著決定作用[7-8]。若細(xì)胞內(nèi)某mRNA含量變化太快，即mRNA數(shù)據(jù)變異度大，則使用RT-qPCR在不同個(gè)體乃至同一個(gè)體中檢測(cè)該mRNA時(shí)，得到的數(shù)據(jù)就可能不一致。mRNA作為推斷損傷時(shí)間的指標(biāo)時(shí)，在相同處理?xiàng)l件下，mRNA數(shù)據(jù)是否均一關(guān)系到損傷時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性。若mRNA數(shù)據(jù)變異度大，則損傷時(shí)間推斷的窗口較大；若mRNA數(shù)據(jù)高度一致，則可以縮小損傷時(shí)間推斷的窗口。此外，有研究[9-10]指出，mRNA的表達(dá)在個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間變異過(guò)大，不利于損傷時(shí)間推斷。因此，尋找個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間變異較小的mRNA是利用mRNA推斷損傷時(shí)間要解決的首要問(wèn)題。

PUM2是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，能通過(guò)其特定的結(jié)構(gòu)域與mRNA靶向結(jié)合以阻斷翻譯起始復(fù)合物的形成，抑制靶基因的表達(dá)[11]。在骨骼肌中，PUM2調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的收縮[12]。TAB2在機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)控中主要促進(jìn)炎癥反應(yīng)及時(shí)有效地終止[13]。本研究中，TAB2 mRNA在骨骼肌損傷修復(fù)中的相對(duì)表達(dá)量降低，可能是因?yàn)樵趽p傷早期肌細(xì)胞主動(dòng)降低炎癥的抑制因素，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，吞噬壞死、溶解的組織細(xì)胞，為后期骨骼肌的再生與重塑作準(zhǔn)備。Cx45是一種縫隙連接通道蛋白，參與電信號(hào)在細(xì)胞之間傳遞。處于發(fā)育階段的成肌細(xì)胞或損傷細(xì)胞中Cx45等縫隙連接蛋白的表達(dá)較多[14]，縫隙連接蛋白參與肌細(xì)胞增殖、分化、聚集及融合，促進(jìn)骨骼肌組織損傷修復(fù)[15]。CHRNA1是煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）的重要亞型之一，可與AChR結(jié)合并激活后者，引起節(jié)神經(jīng)元和骨骼肌興奮[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌損傷后 16、24、40、44、48h CHRNA1 mRNA 的表達(dá)上調(diào)，可能是由于損傷骨骼肌內(nèi)CHRNA1也受到了形態(tài)或功能上的損害，細(xì)胞受到刺激后新合成CHRNA1 mRNA，為蛋白分子的合成作準(zhǔn)備。

本研究從CV極值的存在與否、累積變異度大小、CV的集中趨勢(shì)和離散趨勢(shì)三個(gè)角度，分析PUM2、TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 表達(dá)在個(gè)體間的同質(zhì)性大小。大鼠骨骼肌損傷48h內(nèi)，PUM2、TAB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)較大CV，而Cx45、CHRNA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的CV較小，累積變異度從大到小分別為PUM2 mRNA、CHRNA1 mRNA、TAB2 mRNA和Cx45 mRNA，PUM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的CV比 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量高，但尚不能認(rèn)為 TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA三者相對(duì)表達(dá)量之間存在差別。在一定程度上，CVCV也反映四個(gè)指標(biāo)在損傷后個(gè)體間mRNA表達(dá)的同質(zhì)性。SNK分析結(jié)果并不支持TAB2、Cx45、CHRNA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量CV的平均水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以進(jìn)一步分析CVCV發(fā)現(xiàn)，另三個(gè)CVCV從大到小分別為 TAB2 mRNA、Cx45 mRNA、CHRNA1 mRNA。以上結(jié)果表明，在大鼠骨骼肌挫傷修復(fù)中，PUM2 mRNA的同質(zhì)性最低，TAB2 mRNA次之，Cx45 mRNA和CHRNA1 mRNA的同質(zhì)性較高。由此可見(jiàn)，參與生物過(guò)程調(diào)控作用的PUM2 mRNA和TAB2 mRNA表達(dá)在不同生物個(gè)體間差異較大，而作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成的Cx45 mRNA和CHRNA1 mRNA在不同生物個(gè)體間表達(dá)差異較小。

綜上所述，參與生物過(guò)程調(diào)控作用的mRNA可能導(dǎo)致RT-qPCR在同一個(gè)體或不同個(gè)體間檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)不一致，即mRNA數(shù)據(jù)離散度大，同質(zhì)性低，而參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成的mRNA指標(biāo)同質(zhì)性較高，因此在篩選用于損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)時(shí)應(yīng)注意其功能分類(lèi)。