安曉穎 楊永輝 朱桂云 方鵬 白洪忠 章志華

結(jié)核性胸膜炎目前常用的檢測方法主要包括胸膜活檢、胸腔積液檢測、胸部CT掃描等[1-3]，但其檢查陽性率低、培養(yǎng)周期長且活檢創(chuàng)傷性較大，容易導(dǎo)致漏診及誤診。近年來結(jié)核性胸膜炎發(fā)病過程、發(fā)病機(jī)制的研究越來越深入，以γ-干擾素(IFN-γ)為主的輔助性T細(xì)胞1(Th1)型免疫應(yīng)答在結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，一些基于細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測方法為結(jié)核性胸膜炎的診斷開辟了新的途徑[4-5]。

細(xì)胞免疫是機(jī)體抗結(jié)核感染的主要途徑，結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中分泌蛋白抗原85B(Ag85B)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)是MTB生長過程中的主要分泌蛋白，具有高度的保護(hù)性免疫能力[6-8]。它可激活CD4+T 淋巴細(xì)胞(簡稱“CD4+細(xì)胞”)，并促使Th1增殖，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)抗體產(chǎn)生和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬消化MTB的能力。因此，筆者采用MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白對不同組別患者胸腔積液和外周血細(xì)胞成分進(jìn)行刺激，通過流式細(xì)胞檢測上述融合蛋白刺激后T淋巴細(xì)胞分泌抗原特異性IFN-γ的水平，以評價此種方法在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價值。

資料和方法

一、資料

1．研究對象：所選患者均為2014年1月至2015年1月河北省胸科醫(yī)院住院患者。本次研究入選結(jié)核性胸膜炎患者45例，男31例，女14例，年齡20～45歲，平均(35.13±6.77)歲；非結(jié)核性胸膜炎患者26例，男14例，女12例，年齡20～45歲，平均(33.46±7.56)歲。健康體檢者25名，體檢各項指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，其中男14名，女11名，年齡20～45歲，平均(33.96±7.81)歲。研究對象性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2．納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有研究對象均無心、肝、腎等臟器并發(fā)癥及其他感染，無糖尿病、自身免疫相關(guān)性或免疫性疾病，3個月內(nèi)無重大手術(shù)及外傷史，未用過免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等藥物，未行胸膜腔內(nèi)藥物治療；(2)結(jié)核性胸膜炎患者診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《臨床診療指南·結(jié)核病分冊》[9]，符合以下條件：①胸膜活檢提示抗酸染色陽性的肉芽腫性病變；②胸腔積液或胸膜活檢涂片及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，或TB-DNA檢測陽性；③胸膜活檢提示肉芽腫性病變，抗酸染色涂片陰性，但臨床及影像學(xué)檢查支持結(jié)核，且抗結(jié)核藥物治療有效；(3)非結(jié)核性胸膜炎患者納入標(biāo)準(zhǔn)，臨床診斷不是由結(jié)核分枝桿菌感染所引發(fā)的類肺炎性胸腔積液和惡性胸腔積液患者；(4)健康人群均為至我院體檢中心進(jìn)行常規(guī)體檢者，符合納入標(biāo)準(zhǔn)(1)且無納入標(biāo)準(zhǔn)(2)和納入標(biāo)準(zhǔn)(3)情況的體檢人員。所有研究對象在采集標(biāo)本前均告知并征得本人同意并簽署知情同意書。研究方案取得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 不同組別研究對象的性別和年齡比較

注a：結(jié)核組與非結(jié)核組比較；b：非結(jié)核性組與健康組比較；c：結(jié)核組與健康組比較

二、方法

1．標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉(購自北京曠博生物技術(shù)有限公司)，使用前2000×g離心10 s，加入250 μl 稀釋緩沖液，混勻冰浴5 min，取一支八連排管，標(biāo)記1～8，每管加入120 μl 稀釋緩沖液，取60 μl標(biāo)準(zhǔn)品原液加入1號管，混勻，由1號管依次轉(zhuǎn)移60 μl到下一管混勻至7號管，8號管為本底，完成梯度稀釋(3倍稀釋)。

2．標(biāo)本采集及處理：所有研究對象，使用肝素和乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管分別采集外周血4～6 ml；結(jié)核性胸膜炎患者和非結(jié)核性胸膜炎患者接受規(guī)范的胸腔穿刺抽液術(shù)，收集新鮮胸腔積液50 ml，2 h內(nèi)送檢；結(jié)核性胸膜炎患者和非結(jié)核性胸膜炎患者的活檢組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)或細(xì)針穿刺獲得，使用4%甲醛固定24 h，常規(guī)病理取材、包埋、制片。

3．外周血和胸腔積液中IFN-γ水平測定：收集的外周血和胸腔積液在30 min內(nèi)，1000×g離心10 min，取上清，根據(jù)Aimplex?Human custom 5-plex kit(貨號T1C052806，購自北京曠博生物技術(shù)有限公司)說明書，使用流式細(xì)胞儀[型號NovoCyte D1040，購自艾森生物(杭州)有限公司]測定IFN-γ的含量。

4． MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血和胸腔積液細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平的測定：使用淋巴細(xì)胞密度分離液，分離外周血和胸腔積液中單個核細(xì)胞(PBMCs)。將得到的細(xì)胞使用MD-AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，計數(shù)板計數(shù)，稀釋至2×105個細(xì)胞/ml，取200 μl于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白(Ag85B-ESAT6融合蛋白終濃度為1 mg/L)[10]。將培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，孵育16～18 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用流式細(xì)胞儀，根據(jù)Aimplex?Human custom 5-plex kit說明書，測定IFN-γ水平。

5．免疫組織化學(xué)染色(IHC染色)檢測：活檢組織標(biāo)本石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)和內(nèi)源過氧化物酶清除等步驟后，流水沖洗干凈待用；除去切片上的水分，在離活檢病灶組織3 mm處用IHC油筆(PEN-0002，邁新)畫圈，加CD4(ab133616，abcam)和CD8(ab85792，abcam)一抗室溫孵育1 h，PBS沖洗3次；加二抗孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗3次，蘇木精染色，吹干封片，鏡下觀察拍照，采用Image-Pro plus軟件檢測，以積累光密度值(IOD值)均值表示并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前血清和胸腔積液中IFN-γ水平比較

在未使用MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前，結(jié)核組與非結(jié)核組血清中IFN-γ的含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.747，P=0.085)；結(jié)核組與健康組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.412，P=0.163)；非結(jié)核組與健康組血清中IFN-γ的含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.317，P=0.752)(表2)。

在MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前，非結(jié)核組患者胸腔積液中IFN-γ含量為(47.99±11.49) pg/ml，結(jié)核組患者胸腔積液中IFN-γ含量為(411.91±41.56) pg/ml，結(jié)核組患者IFN-γ含量高于非結(jié)核性胸膜炎組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=55.194，P<0.001)(表3)。

二、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后外周血和胸腔積液中單個核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平的比較

結(jié)核組、非結(jié)核組和健康組研究對象外周血中單個核細(xì)胞經(jīng)過MTB Ag85B-ESAT-6融合蛋白刺激后， IFN-γ含量分別為(401.90±72.54) pg/ml，(40.04±6.80) pg/ml和(39.86±6.97) pg/ml，結(jié)核組與非結(jié)核組、健康組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為33.211、33.204，P值均<0.05)。非結(jié)核組與健康組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.094，P=0.925)(表4)。

表2 不同組別MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前血清中IFN-γ含量比較

注a：結(jié)核組與非結(jié)核組比較；b：非結(jié)核性組與健康組比較；c：結(jié)核組與健康組比較

表3 結(jié)核與非結(jié)核組胸腔積液行MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后的IFN-γ含量比較

注刺激前結(jié)核組與非結(jié)核組比較(t=55.194，P=0.000)，刺激后結(jié)核組與非結(jié)核組比較(t=51.478，P=0.000)，刺激后結(jié)核性胸膜組與刺激前非結(jié)核組比較(t=51.499，P=0.000)

表4 不同組別MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血中單個核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ含量比較

注a：結(jié)核組與非結(jié)核組比較；b：非結(jié)核組與健康組比較；c：結(jié)核組與健康組比較

結(jié)核組和非結(jié)核組患者胸腔積液中單個核細(xì)胞經(jīng)過MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后，結(jié)核組患者的IFN-γ含量為(1342.67±167.96) pg/ml，非結(jié)核組患者的IFN-γ含量為(48.76±11.25) pg/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=51.478，P=0.000)(表3)。

三、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后外周血和胸腔積液中IFN-γ水平的比較

結(jié)核組外周血中單個核細(xì)胞經(jīng)MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后與刺激前血清中IFN-γ的含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.879，P<0.001)。非結(jié)核組和健康組患者外周血刺激前后IFN-γ的含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為0.554、0.122，P值均>0.05)(表5)。

結(jié)核組患者胸腔積液中單個核細(xì)胞經(jīng)MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后較刺激前胸腔積液中IFN-γ含量升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=36.085，P=0.000)。結(jié)核組患者胸腔積液刺激后較非結(jié)核組患者刺激前IFN-γ的含量比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=51.499，P<0.001)。非結(jié)核組患者胸腔積液刺激前后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.244，P=0.808)(表3)。

四、IHC染色檢測結(jié)果

采用IHC染色的方法檢測結(jié)核與非結(jié)核組患者組織標(biāo)本中CD4+和CD8+細(xì)胞的分布情況(圖1～4)，檢測結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜炎患者組織標(biāo)本中CD4+和CD8+細(xì)胞的IOD值分別為(16 349.91±2376.36)和(10 525.77±1164.86)，非結(jié)核組患者組織標(biāo)本中CD4+和CD8+細(xì)胞的IOD值分別為(1853.64±670.40)和(1327.15±175.55)；結(jié)核組患者的CD4+和CD8+細(xì)胞量與非結(jié)核組比較顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為14.381、19.127，P值均為0.000)。

表5 不同組別MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后外周血中IFN-γ含量的比較

圖1 非結(jié)核組CD4+細(xì)胞染色(IHC染色 × 4) 圖2 結(jié)核組CD4+細(xì)胞染色(IHC染色 × 20) 圖3 非結(jié)核組CD8+細(xì)胞染色(IHC染色 × 4) 圖4 結(jié)核組患者CD8+細(xì)胞染色(IHC染色 × 20)

討 論

結(jié)核性胸膜炎是胸腔積液的常見原因，發(fā)生于胸膜腔局部。主要臨床表現(xiàn)為胸膜充血、血管通透性改變、中性粒細(xì)胞浸潤，隨著病情進(jìn)展胸膜表面有纖維素性滲出，繼而出現(xiàn)漿液滲出。傳統(tǒng)的檢測方法包括胸膜活檢、胸腔積液檢驗、胸部 CT掃描等，由于創(chuàng)傷性大或檢測陽性率低等因素為結(jié)核性胸膜炎的診斷及治療帶來挑戰(zhàn)。隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的進(jìn)展，一些基于細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測方法已經(jīng)用于臨床檢測[11]。

結(jié)核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ作為抗結(jié)核感染免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，通過體外測定其表達(dá)水平能夠有效判定機(jī)體結(jié)核分枝桿菌感染情況。目前，對于胸腔積液γ干擾素釋放試驗(IGRA)的臨床應(yīng)用研究比較廣泛，Ates等[12]發(fā)現(xiàn)胸腔積液標(biāo)本采用QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) 技術(shù)檢測結(jié)核性胸膜炎的準(zhǔn)確性較差。筆者采用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)核性胸膜炎患者和非結(jié)核胸膜炎患者外周血和胸腔積液標(biāo)本中IFN-γ的含量及健康人外周血中IFN-γ的含量，結(jié)果顯示，結(jié)核組、非結(jié)核組及健康組血清中IFN-γ的含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但結(jié)核性胸膜炎患者組胸腔積液中IFN-γ的含量要顯著高于非結(jié)核性胸膜炎患者組(P<0.05)，與Liu等[13]的研究結(jié)果一致，表明胸腔積液IGRA檢測特異度高于外周血。同時免疫組織化學(xué)染色顯示，結(jié)核組病灶組織中CD4+和CD8+細(xì)胞的表達(dá)要顯著高于非結(jié)核組，表明CD4+細(xì)胞在結(jié)核病的免疫保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，而且這些免疫細(xì)胞還可刺激 CD8+細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)并促進(jìn)體液免疫反應(yīng)的發(fā)生[14-15]。

結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)免疫原性Ag85復(fù)合物抗原是結(jié)核分枝桿菌中早期的主要分泌性蛋白質(zhì)，含量十分豐富，其中，Ag85B不但參與分枝菌酸的合成，影響細(xì)菌細(xì)胞壁的最終裝配，參與補體受體介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌吞噬作用，對結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的行為有重要影響[16]。ESAT6由RD1(region of difference 1)基因區(qū)域編碼，是結(jié)核分枝桿菌在感染早期的分泌性蛋白質(zhì)，具有免疫保護(hù)力。該抗原可被感染了結(jié)核分枝桿菌的動物或患者有免疫活性的T淋巴細(xì)胞所識別，并產(chǎn)生高水平的IFN-γ；同時也具有刺激B淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抗原決定簇[17]。何宗林和杜先智[18]研究顯示，Ag85B-ESAT6融合蛋白可誘導(dǎo)長期抗結(jié)核免疫記憶，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。筆者采用Ag85B-ESAT6融合蛋白[19-20]對不同患者來源的胸腔積液及外周血樣本中分離的細(xì)胞成分進(jìn)行刺激，顯示結(jié)核組刺激前后外周血和胸腔積液中IFN-γ含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而非結(jié)核組和健康組在刺激前后的IFN-γ含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，提示結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液和外周血中單個核細(xì)胞經(jīng)Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IFN-γ，該方法對結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷有很高的價值[21]。

綜上所述，Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后能顯著提高結(jié)核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ的含量，對于結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷有較高的臨床應(yīng)用價值。