劉婷婷 楊發(fā)燈 林志淼 汪慧君 胡凌寒 鐘偉龍 楊勇

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科

先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗?。╝utosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI）是臨床上表現(xiàn)為全身皮膚鱗屑為特征的一組具有異質(zhì)性的皮膚疾病。主要分為板層狀魚鱗?。╨amellar ichthyosis，LI）、先天性魚鱗病樣紅皮?。╟ongenital ichthyosiform erythroderma，CIE）、丑角樣魚鱗?。╤arlequin ichth?yosis，HI）三種亞型［1］。板層狀魚鱗病主要臨床特征是大片深灰或棕色鱗屑、角化過度，無或輕度紅皮病，而先天性魚鱗病樣紅皮病表現(xiàn)為廣泛分布小的白色鱗屑和程度不等的紅皮病。丑角樣魚鱗病癥狀最嚴(yán)重，出生時新生兒全身緊密包裹膠樣膜、亮紅色滲血的皮膚裂口和皸裂、嚴(yán)重的瞼外翻、唇外翻和耳部畸形，一般早產(chǎn)或出生后數(shù)日或數(shù)周內(nèi)死亡。目前已證實的致病基因包括：TGM1、ALOX12B、ALOXE3、ABCA12、CYP4F2、NIPAL4、SDR9C7、LIPN、CERS3、PNPLA1、ST14、CASP14、ABHD5、SLC27A4、SULT2B1［1?5］，其中ABCA12 突變較少，約占5%［6］。ABCA12基因突變的病例主要集中在非洲、歐洲以及日本等地區(qū)，而我國相關(guān)報道較少。我們在臨床中收集了兩個ABCA12基因復(fù)合雜合突變的ARCI家系，進(jìn)一步探究ABCA12基因突變與臨床表型之間的聯(lián)系。

資料和方法

1.臨床資料：例1，男，23歲，出生時身體廣泛發(fā)紅伴火棉膠樣改變，之后全身漸脫屑。體檢：軀干、四肢及面部輕微紅皮病癥狀伴白色細(xì)小鱗屑，雙手屈曲伴輕度攣縮，皸裂性掌跖角化（圖1A），診斷：輕型CIE。例2，女，30歲，早產(chǎn)，出生時全身皮膚發(fā)紅、緊繃，伴瞼外翻，后全身皮膚角化、脫屑，手指屈曲伴輕度攣縮。體檢：全身廣泛發(fā)紅，游離片狀白色鱗屑，雙眼瞼外翻，瘢痕性禿發(fā)，手指屈曲伴輕度攣縮，皸裂性掌跖角化（圖1B），診斷：重型CIE。2例患者的父母均否認(rèn)近親婚配，否認(rèn)家族有類似病史。

圖1 先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病患者臨床特征 1A：例1腹部及大腿輕微紅皮癥狀伴白色細(xì)小鱗屑，手指屈曲伴輕度攣縮，皸裂性掌跖角化；1B：例2面部紅斑、眼瞼外翻、瘢痕性禿發(fā)，背部游離片狀白色鱗屑，皸裂性掌跖角化，手指屈曲伴輕度攣縮

2.基因組DNA提?。航?jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)2例患者父母簽署知情同意書。分別取2例患者及其父母外周血2 ml，使用全基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA。

3.基因芯片篩選可疑突變基因及位點：先使用Covaris打斷法將樣品DNA打碎至100～700 bp片段，再進(jìn)行末端修復(fù)，加“A”及產(chǎn)物純化，最后進(jìn)行文庫擴(kuò)增PCR和質(zhì)檢，建庫成功。經(jīng)過生物素標(biāo)記的探針（北京邁基諾基因科技股份有限公司）與文庫DNA在一定條件下雜交，用鏈霉親和素修飾的磁珠共價結(jié)合生物素標(biāo)記的探針，抓取目的基因，用磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠洗脫純化，富集目的基因，再應(yīng)用NextSeq 500高通量測序儀（美國Illumina公司）測序。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估和去除銜接子、低質(zhì)量reads（測序片段）及短序列（＜40 bp）等預(yù)處理，BWA比對軟件將預(yù)處理后數(shù)據(jù)與人基因組（hg19）比對，再用GATK的Realigner Target Creator和Indel Realigner工具對Indel區(qū)域的reads重新做局部多序列比對，對堿基質(zhì)量值經(jīng)過矯正后，使用GATK的Haplotype Caller來檢測SNP和INDEL。將得到的序列結(jié)果在數(shù)據(jù)庫（包括千人基因組數(shù)據(jù)庫、ESP6500、inhouse、外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫）中比對，對可疑的致病基因及突變位點進(jìn)行篩選、標(biāo)注，最后嚴(yán)格按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）指南進(jìn)行致病性分析，找到可疑致病基因及突變位點。另外在分析中使用SIFT、Polyphen?2及Mutation Taster等軟件進(jìn)行功能預(yù)測。

4.Sanger法驗證：通過primer blast網(wǎng)站，在ABCA12基因各個突變位點所在外顯子的上下游設(shè)計引物，第21號外顯子上游5′-GCATAACGACCCA TTTTCTTTGG-3′，下游5′-TGGTTGCCTACATGAAA GGTTCT-3′；47號外顯子上游5′-ATCAAAGTCACT GACCACCATGA-3′，下游 5′-CACGGGCCAAGGAG TTTCTAA-3′；42號外顯子上游5′-CTACTTGGTGC CTGTAGCGT-3′，下游5′-AGTCCTATTTGTGTCTAG GGGC-3′；50號外顯子上游5′-TGCTCATGAACTTC AACCCAAG-3′，下游5′-TCCTTGAATCTGAGTGAG CACC-3′，引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，2例患者及其父母的DNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，再用Sanger測序法進(jìn)行雙向測序（ABI3730xl測序儀，天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司）。測序結(jié)果包括目的外顯子所有序列及兩側(cè)至少30 bp側(cè)翼序列，純化后的測序結(jié)果與Ensembl genome browse 90所公布的序列雙向?qū)Ρ取?/p>

結(jié) 果

例1在ABCA12基因的21和47號外顯子分別出現(xiàn)c.2759A＞G（p.N920S）和c.7004A＞G（p.Y2335C）復(fù)合雜合錯義突變（圖2A），其中c.2759A＞G突變來自母親，c.7004A＞G突變來自父親。例2ABCA12基因在42號外顯子存在c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）雜合移碼突變，50號外顯子存在c.7406G＞A（p.C2469Y）雜合錯義突變（圖2B），其母親攜帶c.6163_6164insT突變，其父親攜帶c.7406G＞A突變。使用SIFT，Polyphen?2及Mutation Taster軟件對上述3個錯義突變進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果均顯示其可能的致病作用，另外1個移碼突變c.6163_6164insT編碼的截斷蛋白也可能影響蛋白質(zhì)功能（表1）。

圖2 2例先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病ABCA12基因測序結(jié)果及突變位點 例1在21和47號外顯子出現(xiàn)c.2759A＞G（p.N920S）和c.7004A＞G（p.Y2335C）復(fù)合雜合錯義突變；例2在42和50號外顯子存在c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）雜合移碼突變和c.7406G＞A（p.C2469Y）雜合錯義突變

圖3 ABCA12蛋白結(jié)構(gòu)［8］及患者的突變位點 p.N920S位于N末端區(qū)域；p.Y2335C和p.C2469Y位于第2個核苷酸結(jié)合區(qū)域；p.K2057Qfs*8位于第2個跨膜區(qū)域中2和3號螺旋跨膜區(qū)之間。黑色的p.Y2335C、p.C2469Y已被報道，紅色的p.N920S、p.K2057Qfs*8為新突變

表1 兩個先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病家系A(chǔ)BCA12基因突變功能預(yù)測

討 論

根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，ARCI可以分為三個亞型，但不同亞型患者表型會有一定重疊。即使同一亞型，ARCI隨病程發(fā)展也會表現(xiàn)出不同程度的變化。本文2例患者，盡管都診斷為CIE，但除了具有相同的手指屈曲伴輕度攣縮、皸裂性掌跖角化特征外，例2在紅皮病程度、鱗屑的形態(tài)和大小上比例1表現(xiàn)得更嚴(yán)重，而且還伴雙眼瞼外翻、瘢痕性禿發(fā)。因此，例1和例2分別診斷為輕型CIE和重型CIE。

ABCA12基因位于2號染色體（2q34），是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族成員，可編碼一種主要在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCA12蛋白主要由兩個高度保守的核苷酸結(jié)合區(qū)域、兩個保守的跨膜區(qū)域組成。核苷酸結(jié)合區(qū)域位于細(xì)胞內(nèi)，包含Walker A、Walker B、Q、D、H-loop、ATP結(jié)合位點等元件，而每個跨膜區(qū)域由6個螺旋跨膜區(qū)組成［7］（圖3）。ABCA12蛋白可利用ATP來轉(zhuǎn)運(yùn)包含神經(jīng)酰胺在內(nèi)的脂質(zhì)通過細(xì)胞膜［8］，在顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞中高爾基體向板層小體的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和表皮分化過程中發(fā)揮重要作用［9］。故該基因功能缺陷會導(dǎo)致板層小體的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙且降低顆粒層細(xì)胞間的脂質(zhì)水平［10］。迄今，在外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫可發(fā)現(xiàn)100多個ABCA12基因突變，且不同位點ABCA12基因突變會引起不同程度的表型［11］。移碼突變、無義突變、剪接突變及片段插入缺失的突變都會編碼截斷蛋白甚至完全改變氨基酸序列，從而嚴(yán)重地影響蛋白功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的HI。純合或復(fù)合雜合錯義突變對蛋白功能干擾比較小，一般只會引起不同癥狀的LI和CIE。在ABCA12基因突變中，超過93%會導(dǎo)致嚴(yán)重的HI，只有5%～7%引起癥狀較輕的LI或CIE［1,12］。ABCA12基因突變與患者臨床表型具有緊密聯(lián)系，可通過研究ABCA12基因突變?yōu)锳RCI患者及家庭提供遺傳咨詢。

本研究中，c.7004A＞G和c.7406G＞A已被報道與ARCI相關(guān)［7，11］，而c.2759A＞G、c.6163_6164insT在千人基因組數(shù)據(jù)庫和外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫均未檢到，為新發(fā)現(xiàn)的突變位點。p.Y2335C和p.C2469Y分別位于高度保守的第2個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域中ATP結(jié)合位點附近和末端部位，突變可能會干擾ATP結(jié)合。例1家系中發(fā)現(xiàn)，新突變位點c.2759A ＞ G（p.N920S）在UniProt與天冬酰胺N-連接糖基化修飾位點相關(guān)，當(dāng)?shù)?20位天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸時，使N-連接糖基化消失，可能會干擾ABCA12蛋白信號傳導(dǎo)或正確折疊［13］，p.N920S很可能對ABCA12蛋白正常結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一定影響。復(fù)合雜合錯義突變p.N920S和p.Y2335C使例1出現(xiàn)比較典型的火棉膠嬰兒，軀干、四肢及面部輕微紅皮病癥狀伴白色細(xì)小鱗屑、皸裂性掌跖角化、手指屈曲伴輕度攣縮等特征，臨床診斷為輕型CIE。例2家系中，新突變p.K2057Qfs*8位于第2個跨膜區(qū)域的2和3號螺旋跨膜區(qū)之間，其編碼的截斷蛋白因缺少部分氨基酸片段，會破壞ABCA12蛋白的完整性，突變功能預(yù)測得分1.000（Mutation Taster），其必然不利于正常蛋白功能。潘瓊等［14］報道的1例HI中移碼突變c.6167_6168insT（p.F2056Ffs*9）與本研究的c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）作用相似，都可能較嚴(yán)重地影響該蛋白功能，但HI患者的另一個無義突變c.3673C＞T（p.R1225*）位于第25號外顯子，使第1225位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，即ABCA12蛋白的2個核苷酸結(jié)合區(qū)域和第2個跨膜區(qū)域完全缺失，它對ABCA12蛋白功能的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于例2的錯義突變c.7406G＞A（p.C2469Y），所以移碼突變 c.6167_6168insT（p.K2057Qfs*8）和無義突變 c.3673C＞T（p.R1225*）可能導(dǎo)致具有致死性的HI亞型［14］。本研究中的例2與例1相比可證明移碼突變帶來的影響比錯義突變更嚴(yán)重，與已報道HI患者相比可證明無義突變具有更大危害性。不同ABCA12基因突變和ARCI臨床表型具有緊密關(guān)聯(lián)。

總之，本文確定了2個ARCI相關(guān)的ABCA12基因新突變c.2759A＞G和c.6163_6164insT，首先報道了天冬酰胺N-連接糖基化修飾位點相關(guān)的突變，分析了不同突變可導(dǎo)致不同的表型。對進(jìn)一步明確ABCA12基因突變與ARCI臨床表型之間的聯(lián)系具有一定的意義，并且為這2個ABCA12基因突變相關(guān)ARCI患者及家庭的遺傳咨詢奠定了基礎(chǔ)。