張洋洋 李冰 王剛

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院

銀屑病是以T細(xì)胞免疫紊亂為主的慢性炎癥性皮膚病，發(fā)病機制尚未闡明。目前普遍認(rèn)為，CD4+T細(xì)胞過度活化是銀屑病免疫學(xué)發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)，其中CD4+T細(xì)胞活化后產(chǎn)生的白細(xì)胞介素17（IL?17）是介導(dǎo)銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵細(xì)胞因子［1?2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞也可以分泌IL?17A，且銀屑病患者皮損也有CD8+T細(xì)胞浸潤［3?4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞分群更復(fù)雜且發(fā)揮的功能更豐富。除了細(xì)胞毒性T細(xì)胞外，CD8+T細(xì)胞中還存在發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控功能的CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD8+Treg）和分泌IL?17的Tc17細(xì)胞。CD8+Treg細(xì)胞參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等［5］。Tc17細(xì)胞在銀屑病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病中也發(fā)揮重要作用［6］。本研究探究CD8+T細(xì)胞在銀屑病中發(fā)揮的作用，為CD8+T細(xì)胞在銀屑病等炎癥性皮膚病的機制研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1.皮膚標(biāo)本：銀屑病皮損標(biāo)本來自第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院2017年1-12月明確診斷的8例進(jìn)行期斑塊狀銀屑病，男女各4例，年齡24～50歲，銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI評分）13.2～22.7，均數(shù)為18.3，近3個月未使用系統(tǒng)性藥物，近1周未使用外用藥物及光療。健康對照皮膚取自8例與銀屑病組年齡、皮損取材部位匹配的西京醫(yī)院整形外科手術(shù)剩余皮膚，男女各4例，年齡23～46歲。本研究通過第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（KY20172030?1），受試者均簽署知情同意書。

2.主要試劑：兔抗人CD8α單抗、小鼠抗人CD8α單抗、小鼠抗人CD3單抗、小鼠抗人CD56單抗、小鼠抗人CD11c單抗、小鼠抗人Foxp3單抗、小鼠抗人CD25單抗、兔抗人CD122多抗、兔抗人CD103單抗、兔抗人CCR7單抗、Alexa Fluor 488-山羊抗兔、Cy3-山羊抗鼠、Alexa Fluor 488-驢抗羊二抗（美國Abcam公司），小鼠抗人CD8β單抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司），小鼠抗人CD45RA單抗（美國Biolegend公司），山羊抗人IL?17A抗體（美國R&D Systems公司）、山羊血清（美國Boster Biological Technology公司）。Hochest為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

二、方法

1.免疫熒光：取銀屑病皮損、健康對照皮膚組織，4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)，于山羊血清中室溫孵育30 min，分別滴加50 μl稀釋后的 CD8α、CD3、CD56、CD11c、CD8β、Foxp3、CD25、CD122、CD103、CCR7、CD45RA、IL?17A一抗混合液（稀釋比例按說明書），4℃過夜。次日室溫復(fù)溫1 h，滴加相應(yīng)的二抗復(fù)合物50 μl（1∶200），室溫放置 45 min，洗滌液沖洗，滴加Hochest復(fù)合物（1∶1 000），室溫放置10 min，洗滌液反復(fù)沖洗，甘油封片。激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS公司）于暗室觀察，采集圖像。根據(jù)鏡下熒光強度判斷分子表達(dá)，低倍鏡及高倍鏡下均未見熒光為陰性，低倍鏡下及高倍鏡下均可見熒光為陽性，低倍鏡下可見弱熒光，高倍鏡下明顯可見熒光為陽性。手動計數(shù)表型分子與CD8α共染陽性細(xì)胞占CD8α陽性細(xì)胞百分比。

2.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用Graphpad Prism7軟件，計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、銀屑病皮損浸潤的CD8+細(xì)胞主要是CD8αα+T細(xì)胞

銀屑病組皮損浸潤的CD8+細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)志CD3，不表達(dá)樹突細(xì)胞標(biāo)志CD11c和自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志CD56。銀屑病組CD8+T細(xì)胞中CD8αα+表型占88.48%±7.39%，對照組皮膚局部僅有個別CD8+T細(xì)胞浸潤，CD8αα+表型占14.43% ± 13.14%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.5，P＜0.01）。見圖1。

二、銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞分泌IL?17A

銀屑病皮損中分泌IL?17A的CD8αα+T細(xì)胞占24.85%±4.25%，健康對照組皮膚CD8αα+T細(xì)胞不分泌IL?17A，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.853，P ＜0.01）。見圖2。

圖1 免疫熒光檢測銀屑病皮損與健康人皮膚局部浸潤的CD8+細(xì)胞表型（×600） 銀屑病皮損浸潤的CD8+細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)志CD3，不表達(dá)樹突細(xì)胞標(biāo)志CD11c與自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志CD56，主要為CD8αα+T細(xì)胞

圖2 免疫熒光檢測銀屑病皮損及健康人皮膚局部CD8α與IL-17A共染情況（×600） 銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞分泌IL-17A的比例顯著高于健康對照

三、銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞表型

銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞不表達(dá)CCR7和CD45RA，呈CD45RA-CCR7-效應(yīng)記憶性T細(xì)胞表型，表皮浸潤的CD8αα+T細(xì)胞98.3%±1.0%表達(dá)組織局部定植標(biāo)志CD103，真皮浸潤的CD8αα+T細(xì)胞基本不表達(dá)CD103；健康對照皮膚不表達(dá)CD103（圖3A）。銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞上未見CD8+Treg細(xì)胞標(biāo)志分子Foxp3、CD25和CD122（圖3B）。

圖3 免疫熒光檢測銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞的表型（×600） 3A：銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞不表達(dá)CCR7與CD45RA，表達(dá)CD103，表達(dá)CD8αα+T細(xì)胞浸潤于表皮；3B：銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞上未見CD8+Treg細(xì)胞標(biāo)志分子Foxp3、CD25和CD122

討 論

普遍認(rèn)為，T細(xì)胞免疫紊亂是銀屑病發(fā)病免疫學(xué)機制的中心環(huán)節(jié)［1］。以往研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損局部有CD8+T細(xì)胞浸潤［4］，Boniface等［7］發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損浸潤的CD8+T細(xì)胞部分是組織局部定植細(xì)胞，但其具體細(xì)胞表型尚不明確。CD8+細(xì)胞上表達(dá)的CD8分子有兩種二聚體亞型，包括α鏈組成的同源二聚體CD8αα和α、β鏈組成的異源二聚體CD8αβ，兩者功能有顯著差別。CD8αβ作為T細(xì)胞共受體促進(jìn)細(xì)胞活化，表達(dá)于殺傷性CD8+T細(xì)胞表面。CD8αα通過識別T細(xì)胞受體衍生的肽鏈靶向活化的T細(xì)胞發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控功能［8］，可表達(dá)于CD8+T細(xì)胞，或非T細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞表面［9］。以往研究發(fā)現(xiàn)，在腸道黏膜局部腸上皮淋巴細(xì)胞中，CD8αα+T細(xì)胞表型占43%［10］，在人皮損單純皰疹復(fù)發(fā)皮損局部，CD8αα+T細(xì)胞主要分布于真表皮交界處［11］，而銀屑病皮損浸潤的CD8+T細(xì)胞是否有CD8αα+T表型尚不清楚。

我們發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損真、表皮均有CD8+細(xì)胞浸潤，通過檢測銀屑病皮損CD8α、CD8β及T細(xì)胞標(biāo)志CD3、樹突細(xì)胞標(biāo)志CD11c和自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志CD56，確定了銀屑病皮損浸潤的CD8+細(xì)胞，主要是CD8αα+T細(xì)胞表型。為了進(jìn)一步探究銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞的表型，我們檢測了鑒別初始細(xì)胞分子CD45RA、記憶細(xì)胞分子CCR7與組織局部定植細(xì)胞標(biāo)志CD103［12］。免疫熒光示，銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞呈CCR7-CD45RA-效應(yīng)T細(xì)胞表型。表皮浸潤的CD8αα+T細(xì)胞表達(dá)CD103，真皮浸潤的CD8αα+T細(xì)胞不表達(dá)CD103，提示銀屑病表皮浸潤的CD8αα+T細(xì)胞是組織局部定植細(xì)胞，真皮處細(xì)胞可能來源于外周血。以往研究示，CD8αα+T細(xì)胞作為CD8+Treg細(xì)胞在小鼠腸道黏膜局部免疫中發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用［10］。我們通過檢測CD8+Treg亞群的標(biāo)志Foxp3、CD25和CD122［13］，發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞非CD8+Treg表型，提示CD8αα+T細(xì)胞在銀屑病患者皮損發(fā)揮的作用可能與小鼠腸道的CD8αα+T細(xì)胞不同。

銀屑病發(fā)病機制中，IL?17A是關(guān)鍵的促炎因子［1?2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL?17A不僅來源于CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等也可以產(chǎn)生IL?17A，參與銀屑病發(fā)生發(fā)展［1］。我們發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞分泌IL?17A的細(xì)胞比例顯著高于對照組，提示銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細(xì)胞通過分泌IL?17A參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損處浸潤的CD8+細(xì)胞主要為CD8αα+T細(xì)胞，通過分泌IL?17A參與銀屑病的發(fā)病，拓展了對CD8αα+T細(xì)胞亞群及其功能的認(rèn)識，明確了CD8+T細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用，豐富了銀屑病的免疫學(xué)機制，為CD8+T細(xì)胞在炎癥性疾病中的作用研究提供了新思路。