劉瑞風(fēng) 楊曉紅 梁見(jiàn)楠 張開(kāi)明

030009太原市中心醫(yī)院皮膚科

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。因此，探究其發(fā)病原因及尋找有效治療靶點(diǎn)非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）細(xì)胞因子分泌、免疫調(diào)節(jié)功能及基因表達(dá)均有異常［1?4］。環(huán)狀RNA分子（circRNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新的非編碼調(diào)控RNA，已證實(shí)其參與許多生物學(xué)過(guò)程和人類疾?。??6］。我們用RNA測(cè)序法檢測(cè)銀屑病患者皮損及健康對(duì)照皮膚MSC中circRNA表達(dá)，并進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，從分子水平探討circRNA在銀屑病發(fā)病中的作用。

材料和方法

一、對(duì)象與材料

1.研究對(duì)象：本研究經(jīng)太原市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2014010），所有受試對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。銀屑病患者組15例，男8例，女7例；進(jìn)行期7例，靜止期8例；年齡13～65歲，病程10 d至20年；皮損范圍5%～80%，均為太原市中心醫(yī)院皮膚科臨床及病理確診為尋常性銀屑病的門(mén)診患者，就診前6個(gè)月內(nèi)局部及全身未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、維A酸類藥物、免疫抑制劑及光療。所有患者均依據(jù)銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)估，PASI分值10.33±3.26（范圍1.8～15.0）。對(duì)照組15例，取自我院泌尿外科和整形外科手術(shù)切除的正常皮膚，性別、年齡與患者組1∶1匹配（年齡±2歲），經(jīng)常規(guī)體檢無(wú)系統(tǒng)性疾病，入選時(shí)禁用藥條件同患者組。

2.主要試劑與儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），Dispase酶Ⅱ、胰蛋白酶、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及B27添加劑（美國(guó)Sigma公司），circRNA富集試劑盒（上海云序生物科技有限公司），總RNA文庫(kù)預(yù)處理試劑盒（美國(guó)Illumina公司），Trizol、SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Invitrogen公司），EPICS?XL型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；BioAnalyzer 2100儀器（美國(guó)Agilent公司）；ViiA 7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

二、方法

1.皮膚MSC的分離、培養(yǎng)及鑒定：切取銀屑病患者1.5 cm×1 cm皮損，健康對(duì)照組取同樣大小的正常皮膚。皮膚MSC的分離、培養(yǎng)及流式鑒定方法同文獻(xiàn)［1?2］。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞生長(zhǎng)近90%融合狀態(tài)時(shí)用0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞傳至第5代，收獲細(xì)胞，分別取2×105個(gè)細(xì)胞與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA?DR單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30 min，用PBS洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析、鑒定。

第5代MSC分別用脂肪、骨及軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。脂肪細(xì)胞分化10 d后，用4%甲醛固定，60%異丙醇洗滌，并用油紅O染色。成骨分化3周后，用4%甲醛固定細(xì)胞并用2%茜素紅染色。成軟骨分化21 d后，4%多聚甲醛固定，OCT包埋，切成5 μm切片，甲苯胺藍(lán)染色。

2.RNA文庫(kù)的制備及測(cè)序：每組15例標(biāo)本隨機(jī)分為3個(gè)亞組，每亞組5個(gè)標(biāo)本，進(jìn)行circRNA測(cè)序。使用每個(gè)亞組的總RNA制備circRNA文庫(kù)，包括以下步驟：提取總RNA 5 μg，使用circRNA富集試劑盒富集circRNA；使用TruSeq Stranded總RNA文庫(kù)預(yù)處理試劑盒預(yù)處理RNA，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；使用BioAnalyzer 2100儀器進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)控和定量。根據(jù)Illumina測(cè)序說(shuō)明，將文庫(kù)變性為單鏈DNA分子，在Illumina流動(dòng)池上捕獲，原位擴(kuò)增為簇，并在Illumina HiSeq測(cè)序儀上進(jìn)行150循環(huán)測(cè)序。circRNA測(cè)序由上海云序生物科技有限公司完成。

3.測(cè)序數(shù)據(jù)分析：經(jīng)過(guò)Illumina HiSeq測(cè)序儀測(cè)序，使用CIRI軟件［7］進(jìn)行circRNA檢測(cè)和鑒定，并使用circBase數(shù)據(jù)庫(kù)［8］對(duì)所鑒定的circRNA進(jìn)行注釋，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組樣品的差異circRNA鑒定，通過(guò)倍數(shù)變化和P值進(jìn)行篩選，選擇差異倍數(shù) ≥2，P＜0.05的circRNA作為差異circRNA。對(duì)差異circRNA的來(lái)源基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析，并使用microRNA靶基因預(yù)測(cè) 軟 件 TargetScan 和 miRanda［9?10］進(jìn) 行 circRNA ?microRNA相互作用預(yù)測(cè)。

4.對(duì)挑選的差異circRNA注釋和功能預(yù)測(cè)：挑選7個(gè)差異較大的circRNA構(gòu)建circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

5.實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT?PCR）驗(yàn)證circRNA及microRNA的表達(dá)：對(duì)上述網(wǎng)絡(luò)中的7個(gè)circRNA分子，以GAPDH作為內(nèi)參，使用ViiA 7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT?PCR驗(yàn)證。用Trizol試劑分別提取30例樣本（銀屑病皮損和正常皮膚MSC各15例）總RNA，用SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。從circBase數(shù)據(jù)庫(kù)得到circRNA序列。引物序列見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)采用2?△△Ct方法分析，以±s表示。

為了驗(yàn)證circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)中microRNA的表達(dá)，根據(jù)與這7個(gè)circRNA結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量，挑選了3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量最多的microRNA（hsa?miR?4490，hsa?miR?654?3p和hsa?miR?423?5p）進(jìn)行qRT?PCR分析。管家基因U6作為內(nèi)參，基因表達(dá)變化采用 2?ΔΔCt計(jì)算。ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參；ΔΔCt= ΔCt患者組- ΔCt對(duì)照組。引物序列見(jiàn)表2。

表1 circRNA引物序列

表2 microRNA引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分位數(shù)歸一化和后續(xù)的數(shù)據(jù)處理使用R軟件包>進(jìn)行（ttps：//www.r?project.org/）。所有其他統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件分析。患者組和對(duì)照組qRT?PCR驗(yàn)證采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、皮膚MSC的培養(yǎng)和鑒定

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，患者組和對(duì)照組皮膚MSC表面抗原均高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，而 CD34、CD45 及HLA?DR表達(dá)陰性（圖1）。經(jīng)成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)后，皮膚MSC成功分化為相應(yīng)的細(xì)胞和組織（圖2），分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合MSC的鑒定標(biāo)準(zhǔn)［11］。

二、皮膚MSC的circRNA表達(dá)譜

共檢測(cè)到6 323個(gè)circRNA，其來(lái)源基因的染色體位置分別為：外顯子（3 881，61%），內(nèi)含子（554，9%），正義鏈重疊區(qū)（1 035，16%），反義鏈（747，12%），基因間隔（106，2%），見(jiàn)圖 3A。在這些circRNA中，circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中包含2 810個(gè)；286個(gè)以往被研究者報(bào)道過(guò)，但不包含在circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中；3 227個(gè)以往沒(méi)有被報(bào)道過(guò)，是首次發(fā)現(xiàn)。另外，在6 323個(gè)circRNA中，3 499個(gè)僅在銀屑病皮損中表達(dá)，而1 385個(gè)僅在正常皮膚中表達(dá)，只有1 439個(gè)在兩者中均有表達(dá)，見(jiàn)圖3B。

根據(jù)變化倍數(shù)（≥2.0）和t檢驗(yàn)結(jié)果（P ＜0.05），共鑒定出129個(gè)差異表達(dá)circRNA。與對(duì)照組相比，患者組中123個(gè)表達(dá)上調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)?；鹕綀D（圖3C）和聚類圖（圖3D）顯示出兩組間circRNA表達(dá)的差異。CircRNA測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳到美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE81106）。

三、circRNA預(yù)測(cè)和注釋

挑選7個(gè)表達(dá)差異較大的circRNA，通過(guò)microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行差異circRNA?microRNA相互作用預(yù)測(cè)，它們與microRNA的相互作用網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4。與這7個(gè)差異circRNA關(guān)系密切的銀屑病相關(guān)microRNA包括，miR?17?5p、miR?30e?5p、miR?142?3p/5p、miR?369?3p、miR?184、miR?4490、miR?654?3p和miR?423?5p等，它們之間存在相互作用。

四、qRT?PCR驗(yàn)證結(jié)果

皮膚MSC來(lái)源的7個(gè)circRNA均在患者組高表達(dá)（圖5A），與RNA測(cè)序結(jié)果一致。其中，僅chr14：50053483|50329358和 chr5：170610199|170632616在兩組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.182、7.615，P=0.033、0.001）。根據(jù)預(yù)測(cè)的 circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，挑選與這7個(gè)circRNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量最多的3個(gè)microRNA，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量見(jiàn)圖5B。隨后，采用qRT?PCR方法檢測(cè)了患者組及對(duì)照組各15例標(biāo)本中3個(gè)microRNA的表達(dá)，證實(shí)這3個(gè)microRNA在皮膚MSC中存在，并發(fā)現(xiàn)它們?cè)阢y屑病皮損中低表達(dá)（t=3.993、3.217、2.918，P=0.016、0.032、0.043），見(jiàn)圖5C。

圖4 circRNA注釋與功能預(yù)測(cè) 7個(gè)差異表達(dá)的circRNA與microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，黃色圓圈代表circRNA，綠色三角形代表microRNA

討 論

circRNA是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型非編碼調(diào)控RNA。它們表達(dá)豐富，在進(jìn)化上高度保守，具有組織和/或發(fā)育階段特異性［5］，可以與RNA相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；且富含microRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到microRNA海綿的作用［12］，進(jìn)而解除microRNA對(duì)其靶基因的抑制作用［13?14］，提高靶基因的表達(dá)水平，這一作用機(jī)制被稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA機(jī)制。通過(guò)與疾病關(guān)聯(lián)的microRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

圖5 qRT?PCR驗(yàn)證circRNA及microRNA 5A：7個(gè)差異表達(dá)的circRNA測(cè)序及PCR驗(yàn)證圖；5B：每個(gè)circRNA上microRNA結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量；5C：circRNA?microRNA互作網(wǎng)絡(luò)中挑選的3個(gè)microRNA的PCR驗(yàn)證結(jié)果，a：P＜0.05。每組均為15份標(biāo)本

我們發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損MSC circRNA表達(dá)異常，并報(bào)告了3 227個(gè)新的circRNA。我們共檢測(cè)到6 323個(gè)circRNA，其中大部分來(lái)自外顯子（61%），與以往報(bào)告的結(jié)果一致［12］?；颊呓M與對(duì)照組相比，有129個(gè)circRNA呈差異表達(dá)。為了揭示這些circRNA的作用，在這些差異表達(dá)的circRNA中挑選了7個(gè)差異倍數(shù)較大的circRNA構(gòu)建了circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4）。此網(wǎng)絡(luò)圖表明，這些circRNA與以下microRNA關(guān)系密切，包括miR?17?5p、miR?30e?5p、miR?142?3p/5p、miR?369?3p、miR?184、miR?4490、miR?654?3p和miR?423?5p。值得一提的是，已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR?17?5p、miR?30e?5p和miR?142?3p/5p在銀屑病皮損中差異表達(dá)，且miR?142?3p明確參與表皮的炎癥［15］；銀屑病患者血清和皮損中的miR?369?3p表達(dá)均升高，在皮損中的水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［16］。此外，miR?184在銀屑病皮損中表達(dá)上調(diào)，并直接影響其他microRNA的表達(dá)，可能在角質(zhì)形成細(xì)胞相關(guān)疾病中發(fā)揮獨(dú)特的作用［17］。以上結(jié)果均提示，circRNA可能通過(guò)吸附這些與銀屑病相關(guān)的microRNA從而解除其對(duì)靶基因的抑制作用，使靶基因表達(dá)升高，進(jìn)一步參與銀屑病的發(fā)病。為了證實(shí)這些microRNA的真實(shí)存在，我們挑選其中3個(gè)采用qRT?PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，它們不但在皮膚中存在，而且在銀屑病患者皮損表達(dá)異常（圖5C）。

本研究結(jié)果證實(shí)，銀屑病皮損MSC的circRNA表達(dá)異常。通過(guò)詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，我們認(rèn)為circRNA參與了銀屑病的發(fā)病。本研究結(jié)果及進(jìn)一步的分子機(jī)制深入探討將為銀屑病發(fā)病機(jī)理研究及尋找新的治療靶點(diǎn)提供新思路。本課題只研究了皮膚MSC的circRNA表達(dá)，沒(méi)有研究這些寡核苷酸在角質(zhì)形成細(xì)胞及免疫細(xì)胞中的表達(dá)，并且沒(méi)有進(jìn)入深入的機(jī)理分析。我們目前正在進(jìn)行更廣泛和深入的研究，來(lái)闡明circRNA在銀屑病發(fā)病中的作用。