楊曉飛，王臨旭，黃長形，董 杰，胡海峰，畢占虎，連建奇，張 野

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院) 傳染科，西安 710038

γ鏈(γ chain, γC)細(xì)胞因子家族成員包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，受體為γC受體亞基和特異性α/β受體亞基形成的異源二聚體，在慢性病毒感染過程中調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞功能，影響機(jī)體抗病毒免疫活性[1-2]。T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containning molecule 3, TIM-3)是重要的免疫檢查點(diǎn)分子，主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答的作用[3]。在人免疫缺陷病毒(HIV)感染中，γC細(xì)胞因子可誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)升高，通過相應(yīng)異源二聚體受體介導(dǎo)的信號通路影響下游細(xì)胞因子分泌[4]。本課題組前期研究[5-6]也發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)升高，IL-7和IL-15可增強(qiáng)CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3的表達(dá)，但抑制γC受體亞基并不影響IL-7和IL-15誘導(dǎo)的TIM-3表達(dá)升高。因此，本研究通過抑制CD8+T淋巴細(xì)胞中各種γC細(xì)胞因子受體特異性α/β亞單位，探討γC細(xì)胞因子誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—5月就診于第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科的CHB患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≥18歲；(3)獲得知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1年內(nèi)曾接受抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)治療者；(2)合并其他嗜肝病毒或HIV感染者；(3)合并自身免疫性疾病、酒精性肝炎、藥物性肝損傷者；(4)合并惡性腫瘤者；(5)合并終末期肝臟疾病(包括失代償期肝硬化、肝衰竭、肝癌)者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma公司。小鼠抗人CD3-APC、小鼠抗人CD8-FITC、小鼠抗人TIM-3-PE CF594、小鼠抗人磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1(signal transducer and activator of transcription-1, STAT-1)-PE(磷酸化位點(diǎn)為Y701)、小鼠抗人磷酸化STAT-3-PerCP Cy5.5(磷酸化位點(diǎn)為Y705)、小鼠抗人磷酸化STAT-5-APC(磷酸化位點(diǎn)為Y694)，大鼠抗人IL-2-APC、小鼠抗人IFNγ-FITC、大鼠抗人IL-10-PE購自美國BD公司。重組人IL-7、重組人IL-15、重組人IL-21購自美國PeproTech公司。抗人IL-7Rα、抗人IL-2Rβ、抗人IL-21R、抗γC抗體購自美國R&D公司。流式細(xì)胞儀FACS Aria Ⅱ?yàn)槊绹鳥D公司產(chǎn)品。

1.2.2 外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離 于清晨、空腹采集外周靜脈血20 ml，采用EDTA抗凝，立即使用淋巴細(xì)胞分離液、采用Ficoll密度梯度離心法分離 PBMC。使用0.4%臺盼蘭對PBMC計數(shù)，以5×106個/管分裝在凍存管內(nèi)，加凍存液(90%胎牛血清+10%二甲基亞砜)保存于液氮中備用。

1.2.3 PBMC刺激培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的PBMC，于24孔板中培養(yǎng)，每孔中加入2×105個PBMC，每例患者設(shè)立20個復(fù)孔，每2個復(fù)孔設(shè)立同一刺激因素，分別為：(1)陰性對照(無刺激)；(2)重組人IL-7；(3)重組人IL-7+抗人IL-7Rα；(4)重組人IL-7+抗人IL-7Rα+抗γC；(5)重組人IL-15；(6)重組人IL-15+抗人IL-2Rβ；(7)重組人IL-15+抗人IL-2Rβ+抗γC；(8)重組人IL-21；(9)重組人IL-21+抗人IL-21R；(10)重組人IL-21+抗人IL-21R+抗γC，其中重組人IL-7、重組人IL-15、重組人IL-21的終濃度為25 ng/ml，抗人IL-7Rα、抗人IL-2Rβ、抗人IL-21R和抗γC的終濃度為10 μg/ml。PBMC在5% CO2條件下培養(yǎng)90 h，然后加入終濃度為10 μg/ml的布雷菲爾德菌素A繼續(xù)培養(yǎng) 6 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌 刺激后的PBMC轉(zhuǎn)入2個FACS管中，一管加入抗CD3、抗CD8、抗TIM-3、抗pSTAT-1(或抗pSTAT-3、抗pSTAT-5)，另一管中加入抗CD3、抗CD8、抗IL-2、抗IL-10、抗IFNγ，并設(shè)立同型對照。用FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測，BD FACS Diva軟件獲取細(xì)胞，F(xiàn)lowJo V10軟件分析結(jié)果。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批號：TDLL-201505-013，所有入組志愿者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入CHB患者23例，男14例，女9例，年齡18～41歲，ALT 93～337 U/L，HBV DNA(5.91±1.17)log10IU/ml。

2.2 IL-7對CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3、細(xì)胞因子和pSTAT-5表達(dá)的影響 CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3和細(xì)胞因子分泌、下游pSTAT檢測的典型流式分析(圖1)。首先利用前向角散射(forward scatter, FSC)和側(cè)向角散射(side scatter, SSC)對淋巴細(xì)胞進(jìn)行圈門，在淋巴細(xì)胞中選擇CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞，檢測CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3+比例，進(jìn)一步對CD3+CD8+TIM-3+細(xì)胞中IL-2、IL-10、IFNγ和pSTAT的比例進(jìn)行檢測。重組人IL-7刺激可誘導(dǎo)CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3陽性細(xì)胞比例較無刺激組升高[(20.73±3.56)% vs (11.90±2.32)%，t=9.966，P<0.001]，亦可誘導(dǎo)TIM-3+CD8+細(xì)胞中IL-2陽性[(34.87±10.02)% vs(17.89±6.22)%，t=6.905，P<0.001]、IL-10陽性[(64.22±8.71)% vs (51.14±8.31)%，t=5.211，P<0.001]、IFNγ陽性[(27.52±5.94)% vs (20.90±5.78)%，t=3.831，P<0.001]細(xì)胞比例較無刺激組升高，pSTAT-5陽性細(xì)胞比例亦較無刺激組升高[(38.92±3.67) % vs (25.93±9.68)%，t=6.018，P<0.001]?？谷薎L-7Rα刺激對IL-7刺激組的TIM-3、IL-2、IL-10、IFNγ和pSTAT-5表達(dá)均無顯著影響(P值均>0.05)?？谷薎L-7Rα和抗γC聯(lián)合刺激后可降低IL-7刺激組的TIM-3(16.10±2.01)%、IL-2(18.01±8.27)%和IL-10(55.61±2.89)%表達(dá)水平(P值均<0.05)，但對IFNγ和pSTAT-5表達(dá)無顯著影響(P值均>0.05)(圖2)。

圖1 CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞表面TIM-3和細(xì)胞因子分泌、STAT磷酸化檢測的典型流式分析圖

2.3 IL-15對CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3、細(xì)胞因子和pSTAT-1表達(dá)的影響 重組人IL-15刺激可誘導(dǎo)CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3陽性細(xì)胞比例較無刺激組升高[(23.93±5.92)%，t=9.074，P<0.001]，亦可誘導(dǎo)TIM-3+CD8+細(xì)胞中IL-2陽性[(37.72±9.28)%，t=8.513，P<0.001]、IL-10陽性[(83.92±6.90)%，t=14.550，P<0.001]、IFNγ陽性[(28.53±5.64)%，t=4.531，P<0.001]細(xì)胞比例較無刺激組升高，pSTAT-1陽性細(xì)胞比例亦較無刺激組升高[(40.88±3.69)% vs (25.93±9.68)%，t=6.921，P<0.001]。抗IL-2Rβ單獨(dú)刺激、抗IL-2Rβ和抗γC聯(lián)合刺激均可降低IL-15刺激組的TIM-3、IL-2、pSTAT-1表達(dá)水平(P值均<0.05)，但對IFNγ表達(dá)無顯著影響(P>0.05)(圖3)。

2.4 IL-21對CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3、細(xì)胞因子和pSTAT-1、pSTAT-3表達(dá)的影響 重組人IL-21刺激、抗IL-21R單獨(dú)刺激、抗IL-21R和抗γC聯(lián)合對CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3陽性細(xì)胞比例、TIM-3+CD8+細(xì)胞中IL-2、IL-10、IFNγ、pSTAT-1及pSTAT-3的表達(dá)與無刺激組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P值均>0.05)(表1)。

表1 IL-21對CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3、IL-2、IL-10、IFNγ、pSTAT-1和pSTAT-3表達(dá)的影響

3 討論

CD8+T淋巴細(xì)胞是清除HBV感染的最主要免疫細(xì)胞，但持續(xù)HBV感染可通過誘導(dǎo)固有免疫系統(tǒng)功能紊亂、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平升高、抑制性免疫應(yīng)答異?；钴S等多種機(jī)制影響CD8+T淋巴細(xì)胞活性，導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞功能衰竭，殺傷活性明顯減弱，分泌細(xì)胞因子能力降低，進(jìn)一步誘導(dǎo)HBV感染慢性化[8]。免疫檢查點(diǎn)分子是目前免疫治療的熱點(diǎn)之一，針對程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4, CTLA-4)和TIM-3等代表性免疫檢查點(diǎn)分子均已成為抗腫瘤和慢性感染免疫治療的重要靶點(diǎn)[9-10]。PD-1和CTLA-4在急性和慢性病毒性肝炎患者中的表達(dá)水平升高：在急性肝炎過程中，PD-1和CTLA-4可抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的殺傷活性，降低CD8+T淋巴細(xì)胞對肝細(xì)胞的免疫損傷，發(fā)揮免疫保護(hù)作用；相反，在慢性肝炎過程中，PD-1和CTLA-4則與T淋巴細(xì)胞功能衰竭誘導(dǎo)的持續(xù)病毒感染密切相關(guān)[11]。本課題組既往研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)分子家族中的重要成員——TIM-3在CHB患者CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞中的水平均顯著升高，γC細(xì)胞因子中的成員IL-2、IL-7和IL-15均可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表面TIM-3提升，本研究亦發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果，且與在慢性HIV感染中研究結(jié)果一致[4,12]，說明多種慢性病毒感染中均存在TIM-3升高表達(dá)，以TIM-3為代表的免疫檢查點(diǎn)分子可能與CD8+T淋巴細(xì)胞功能衰竭密切相關(guān)，參與病毒感染慢性化。

注：a，TIM-3+比例；b，IL-2+TIM-3+比例；c，IL-10+TIM-3+比

注：a，TIM-3+比例；b，IL-2+TIM-3+比例；c，IL-10+TIM-3+比例；d，IFNγ+TIM-3+比例；e，pSTAT-1+TIM-3+比例。

既往的研究認(rèn)為γC細(xì)胞因子的主要功能為促進(jìn)炎癥應(yīng)答，雖然這些細(xì)胞因子共享γC受體亞基，但特異性α/β受體亞基所介導(dǎo)的信號通路卻存在差異。IL-7通過IL-7Rα/γC受體介導(dǎo)下游STAT-5磷酸化，IL-15通過IL-2R/γC受體以及抗原提呈細(xì)胞表面的IL-15Rα活化STAT-1介導(dǎo)的信號通路，IL-21通過IL-21R/γC受體介導(dǎo)下游STAT-1、STAT-3磷酸化，調(diào)控免疫細(xì)胞功能[13-14]。γC細(xì)胞因子可調(diào)控慢性HBV和HIV感染者T淋巴細(xì)胞中TIM-3的表達(dá)，在HIV感染者中，IL-2、IL-7、IL-15和IL-21均可上調(diào)T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)[4,12]。但不同γC細(xì)胞因子對CHB患者TIM-3的表達(dá)調(diào)控卻存在差異，IL-7和IL-15可誘導(dǎo)CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)升高，

雖然IL-21在慢性HBV感染中的表達(dá)水平升高，在體內(nèi)和體外均可介導(dǎo)HBV病毒清除[15-16]，但I(xiàn)L-21對CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3的表達(dá)則無顯著影響，這可能與γC細(xì)胞因子家族成員介導(dǎo)的下游信號通路不同有關(guān)[13-14]。同時，抑制IL-21R和/或γC受體對IL-21介導(dǎo)的CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3的表達(dá)變化無影響，提示IL-21對CD8+T淋巴細(xì)胞的功能調(diào)控可能與其受體的表達(dá)水平和功能變化無明顯相關(guān)性，而深入的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

IL-7和IL-15均可顯著增加CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)。IL-7在HCV[17-18]和肝細(xì)胞癌[16]患者外周血中的表達(dá)水平降低，外源性IL-7可降低肝細(xì)胞癌患者CD8+T中PD-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞功能[19]。外源性IL-15在體內(nèi)可抑制HBV復(fù)制[20]，但可上調(diào)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1和TIM-3表達(dá)[21]。雖然IL-7和IL-15在慢性HBV感染中的表達(dá)譜不同，但I(xiàn)L-7和IL-15究竟發(fā)揮免疫增強(qiáng)還是免疫抑制作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-7和IL-15可增強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞表面TIM-3的表達(dá)和下游IL-10的分泌，與CHB患者體內(nèi)負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子通路的激活密切相關(guān)，同時，IL-7和IL-15亦可增強(qiáng)下游IL-2和IFNγ的表達(dá)，說明二者亦可能激活了機(jī)體的免疫應(yīng)答。因此，筆者推測，在慢性HBV感染中，以IL-7和IL-15為代表的γC細(xì)胞因子不但可誘導(dǎo)TIM-3等負(fù)性免疫分子表達(dá)，還可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子激活，使CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖和殺傷活性與負(fù)性免疫調(diào)節(jié)在一定范圍內(nèi)達(dá)到免疫穩(wěn)態(tài)，使機(jī)體既不能清除病毒，也不受到過強(qiáng)的免疫損傷[22]。阻斷IL-7和IL-15的特異性受體亞基可降低下游細(xì)胞因子的分泌，說明慢性HBV感染者中γC細(xì)胞因子可通過與慢性HIV感染者中相似的通路影響下游細(xì)胞因子分泌[4,12]。但由于本研究入組的CHB患者數(shù)量有限，且均為體外實(shí)驗(yàn)，本研究結(jié)果仍需要擴(kuò)大樣本量并以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象進(jìn)行體內(nèi)研究進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

總之，IL-7和IL-15可能主要通過γC受體介導(dǎo)的STAT磷酸化促進(jìn)細(xì)胞因子信號通路，上調(diào)CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞中TIM-3表達(dá)。盡管γC細(xì)胞因子被認(rèn)為是一種治療慢性病毒感染新的免疫方法，但其具體的治療機(jī)制仍需進(jìn)一步闡釋。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊曉飛、董杰、胡海峰、畢占虎負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作和論文撰寫；楊曉飛、王臨旭、黃長形、連建奇、張野負(fù)責(zé)入組患者和數(shù)據(jù)分析；連建奇、張野負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫論文并最后定稿。